Virale infecties. Diagnostische methoden

Kinderen

Menselijke virale infecties

Laboratoriumdiagnostiek van virale infecties



  • radio-isotoop immuunanalyse (RIA),
  • enzym immunoassay (ELISA),
  • immunofluorescentiereactie (RIF),
  • complement fixatie (RCC),
  • reactie van passieve hemagglutinatie (RPHA),
  • hemagglutinatieremming (HGA) en anderen.

Bij gebruik van de methoden van serodiagnostiek is het verplicht om gepaarde sera te onderzoeken. In dit geval dient de viervoudige toename van de antilichaamtiter in het tweede serum in de meeste gevallen als een indicator voor de voortdurende of vers overgebrachte infectie. In de studie van één serum dat wordt ingenomen in de acute fase van de ziekte, is de detectie van antilichamen van IgM-klasse, indicatief voor acute infectie, van diagnostisch belang.

Principes van diagnose van virale ziekten

loading...

Diagnose speelt een beslissende rol in het systeem van maatregelen ter bestrijding van dierziekten virale etiologie.

Een snelle en correct gediagnosticeerde diagnose garandeert succes bij het elimineren van een uitbraak, omdat u hiermee de epizoötie duidelijk kunt identificeren en tijdig gerichte maatregelen kunt nemen om het vee van dieren met het minste verlies te verbeteren.

Om een ​​diagnose te stellen, moet u een hele reeks verschillende gegevens verzamelen, bestuderen, analyseren en vergelijken. Daarom is de diagnose het resultaat van nauwgezet en doordacht werk.

In de eerste fase van de diagnose worden gegevens gebruikt die snel op de boerderij kunnen worden verzameld. Deze omvatten:

epizoötologische gegevens, waaronder informatie over de dekking van de ziekte bij deze dierenpopulatie, de snelheid en territoriale verspreiding van de ziekte, de soorten zieke dieren, de dynamiek van het identificeren van patiënten, enz.;

klinische tekenen van de ziekte. Deze omvatten bepaling (vergeleken met normaal) lichaamstemperatuur, ademhalingsfrequentie en vorm, polsslag, eetstoornissen, gedrag, toestand van de huid en slijmvliezen, het functioneren van het spijsverteringsstelsel, isolatie en tD..;

pathoanatomische veranderingen, die meestal worden vastgesteld bij de ontleding van dode of gedwongen gedode dieren. Onderscheid macroscopische veranderingen (ten opzichte van de norm) de vorm, grootte, kleur, consistentie, het uiterlijk van knobbeltjes, bloedingen, blaasjes en andere entiteiten die niet zijn gevonden in de normale, evenals microscopische veranderingen in cellen en weefsels, gedetecteerd door histologische methoden.

In de meeste gevallen op basis van deze gegevens kan een voorlopige diagnose te stellen, omdat veel virale ziekten hebben vergelijkbare epizootologicheskie data, klinische tekenen en pathologische veranderingen (bijv., Para-influenza-3 virus diarree, ten aanzien van IBR, respiratoir syncytieel en adenovirale infectie van vee of ziekte Newcastle en aviaire influenza, enz.).

Bovendien kan de ziekte vaak niet door één, maar door twee of meer etiologische agentia (bijvoorbeeld een virus en bacteriën of twee of meer virussen) worden veroorzaakt. Zelfs een ziekte zoals mond- en klauwzeer bij runderen kan tamelijk zelfverzekerd worden vastgesteld aan de hand van epizoötische, klinische en pathoanatomische gegevens, maar laboratoriumtests zijn nodig om het type en de variant van de ziekteverwekker te bepalen.

Ondanks de aard van de voorlopige diagnose speelt het een zeer belangrijke rol, omdat het diergeneeskundige specialisten ertoe aanzet relevante activiteiten uit te voeren.

De uiteindelijke diagnose voor een virale ziekte kan in de meeste gevallen alleen worden gesteld met de resultaten van laboratoriumtests. Bij de laboratoriumdiagnose van virale ziekten hangt de nauwkeurigheid van de diagnose voornamelijk af van de juistheid van het nemen van het materiaal (monster) van zieke en dode dieren, het transporteren ervan, de kwaliteit van de bereiding en de techniek van het testen van het virale materiaal.

Materiaal voor de studie moet zo snel mogelijk na het optreden van duidelijke ziekteverschijnselen of niet later dan 1-2 uur na de klinische dood of niveau (later begint bacteriële kolonisatie en tenminste de voortzetting van de hoeveelheid virus infectie kan worden verlaagd met de invloed van de beschermende mechanismen van het organisme).

Bij het nemen van materiaal om het virus te isoleren, moet men uitgaan van de pathogenese van de veronderstelde infectie (toegangspoorten, manieren om het virus in het lichaam te verspreiden, de plaatsen waar het zich voortplant, klinische symptomen en wijzen van toewijzing). Het laboratorium is gericht op het materiaal dat waarschijnlijk pathogenen bevat. De volgende algemene regels moeten worden nageleefd:

het materiaal moet strikt aseptisch worden genomen;

het materiaal moet onmiddellijk worden geconserveerd (geplaatst in een thermosfles met een koelmengsel of door toevoeging van 50% steriele glycerine) om de vernietiging van virussen te voorkomen;

Het materiaal is handiger om steriele reageerbuizen in te nemen met een rubberen stop of in flessen van onder antibiotica. 5-10 g materiaal is voldoende voor het onderzoek;

de reageerbuisjes mogen geen wasbaar etiket hebben; het materiaal wordt verzonden met een brief en een begeleidende brief, met vermelding van de boerderij, het type zieke dieren, de voorlopige diagnose, het type en de hoeveelheid pathologisch materiaal, wat moet worden gedaan, de datum en de naam van de arts.

Afhankelijk van de symptomen van de ziekte, en dus de lokalisatie van de ziekteverwekker van het zieke dier, kan het volgende materiaal worden genomen:

wasbeurten van het neusslijmvlies, ogen, van de achterste farynxwand, rectum en cloaca bij vogels. Neem ze in met steriele wattenstaafjes die worden ondergedompeld in reageerbuizen of injectieflacons met 3-5 ml van de juiste vloeistof (Hanks-oplossing, Eagle's medium, 199, enz.) Met antibiotica;

inhoud van blaasjes, puisten, wanden van vesicles, korsten op de huid; uitwerpselen direct uit het rectum;

bloed om het virus en bloed te isoleren om gepaarde bloedsera te produceren om antilichaamtiters te detecteren en te bepalen. Voor dit doel wordt het bloed tweemaal uit hetzelfde dier genomen - bij het begin van de ziekte en na 2-3 weken, d.w.z. aan het begin en aan het einde van de ziekte.

Van lijken moet pathologisch materiaal worden genomen niet later dan 1-2 uur na de klinische dood of het slachten van het dier. Neem als pathologisch materiaal stukjes van organen die:

zichtbare afwijkingen van de norm hebben;

kan worden beïnvloed en het virus bevatten op basis van het klinische beeld van de ziekte;

bevatten meestal het virus: milt, lever, longen, nieren, hersenen, lymfeklieren.

In het laboratorium wordt een deel van het materiaal voor testen genomen, de rest wordt in de koelkast bewaard voor aanvullende onderzoeken. Vervolgens maken ze een plan voor de studie van het verzonden materiaal, dat de volgende taken omvat: detectie (indicatie) van het virus in het materiaal; isolatie (isolatie) van het virus uit het materiaal; identificatie van het geïsoleerde virus;

indien nodig, is het nodig om de etiologische rol van het geïsoleerde virus te bewijzen;

Principes en methoden voor diagnose van virale infecties

loading...

Het systeem van maatregelen ter bestrijding van virale infecties omvat: diagnose van behandeling en preventie.

Diagnose speelt een beslissende rol in het systeem van maatregelen ter bestrijding van ziekten van de virale etiologie

Diagnose (van het Griekse woord diagnose - herkenning) is een definitie van de aard en de essentie van de ziekte, de vaststelling van de oorzaak en vorm ervan. Het diagnoseproces wordt diagnostiek genoemd. Het bestaat uit drie fasen:

Fase 1 - observatie en onderzoek van zieke dieren;

Fase 2 - analyse en evaluatie van onderzoeksresultaten

Fase 3 - conclusie over de oorzaak, vorm van de ziekte en de toestand van het zieke organisme.

Snel en correct gediagnosticeerd, is dit 50% succes in de strijd tegen een virale infectie, namelijk het stelt je in staat om gerichte maatregelen te nemen om het met het minste verlies te elimineren. Het uitbreken van een virale infectie kan worden vergeleken met een brand. Het eerdere "branden" wordt opgemerkt en hoe eerder het "blussen" werd gestart, hoe minder schade.

Voorbeeld: een pluimveebedrijf in de buurt van Leningrad in 1986 brak een ziekte uit Newcastle uit. De diagnose werd pas na 2 weken gesteld en was onjuist (voor de griep). Als gevolg van een verlate en onjuiste diagnose gingen 3 miljoen vogels verloren. Het voorbeeld laat zien dat het in handen is van dierenartsen die de economie van het land zijn. Daarom moet de diagnose van een virale ziekte zo snel mogelijk en zo nauwkeurig mogelijk worden gesteld.

Als een infectieziekte wordt vermoed, inclusief een virusdiagnose, wordt deze uitgebreid vastgesteld op basis van de volgende gegevens:

1 epizoötische gegevens

2 klinische onderzoeksgegevens

3 van deze pathoanatomische onderzoeken

4 laboratoriumgegevens

Tijdens het diagnosticeren worden twee fasen onderscheiden:

De eerste is klinisch-epizoötisch. Deze fase wordt direct op de plaats van de virusinfectie (in de boerderij, de kwekerij, de pluimveehouderij) uitgevoerd. Op basis van de verzamelde gegevens (epizoötisch, klinisch en pathoanatomisch) wordt een voorlopige diagnose gesteld.

De tweede is laboratoriumdiagnose. Het wordt uitgevoerd in een gespecialiseerde instelling - het virologisch laboratorium of de afdeling. Het voert een onderzoek uit naar het materiaal dat is verkregen uit de plaats van herkomst van de virale infectie en houdt rekening met de voorlopige diagnose. Op basis van de resultaten van laboratoriumtests wordt een definitieve diagnose voor een virale infectie vastgesteld.

De eerste fase begint met het verzamelen en bestuderen van epizoötische gegevens. Dit omvat informatie over de aanwezigheid van een virale infectie in het gebied en wat; over het aantal zieke dieren, hun type, leeftijd, geslacht, fysiologische toestand; over de seizoensgebondenheid van de ziekte, de aanwezigheid van vectoren en reservoirs van infectie, het contact van dieren met de bron van infectie; verspreidingssnelheid van de ziekte; over de komst van nieuwe dieren, herplaatsingen van dieren, vaccinaties en immuniteit. Zo wordt mond- en klauwzeer gekenmerkt door: gebruikelijk in het grensgebied aan de grens met het probleemgebied van deze ziekte treedt alleen evenhoevigen, snelle dekking van de populatie in een korte tijd kunnen vervoerders alle dieren en vogels en mensen, producten van dierlijke oorsprong, enz Klinisch onderzoek van patiënten te beginnen met dierlijke habitus (temperatuur, hartslag, ademhaling, lichaamshouding in de ruimte, temperament, grondwet, vetheid, enz.) En geschiedenis. Vervolgens wordt elk lichaamssysteem onderzocht, waarbij de afwijking van de normale toestand wordt vermeld.

Pathologische veranderingen worden vastgesteld bij de opening van de gevallen of gedwongen gedood dieren. De veranderingen in organen en weefsels worden genoteerd in vergelijking met de norm, de aanwezigheid van neoplasma's.

In een aantal gevallen zijn de klinische en morfologische veranderingen zo kenmerkend dat u een diagnose kunt stellen (pokken, mond- en klauwzeer). Vaak is de ziekte echter atypisch of worden er onmiddellijk tekenen van de ziekte waargenomen met verschillende infecties. Bovendien komen er onlangs gemengde infecties voor wanneer de ziekte niet door één wordt veroorzaakt, maar door twee of meer etiologische agentia (twee virussen of een virus en een bacterie).

Een ander voorbeeld, wanneer zelfs met een infectie als mond- en klauwzeer laboratoriumtests vereist zijn om het type en subtype te bepalen, aangezien immuniteit alleen beschermt tegen het type mond- en klauwzeervirus dat werd gevormd.

Daarom moet in alle gevallen een voorlopige diagnose worden bevestigd door laboratoriumtests.

Dus als gevolg van een klinische en epizoötologische analyse van honderd virusziekten, stopt de dierenarts bij 2-3 infecties en wijst ze op in een begeleidend document voor het biomateriaal dat naar het virologisch laboratorium wordt gestuurd.

De resultaten van laboratoriumonderzoeken zijn grotendeels afhankelijk van de juistheid van het nemen en verzenden van het biomateriaal (pathologisch) materiaal voor deze onderzoeken.

De basisvereisten voor het nemen en doorsturen van het biomateriaal zijn als volgt:

1 Het materiaal wordt genomen aan het begin van de klinische manifestatie van de virale ziekte. Omdat het maximale gehalte van het virus in de weefsels van het lichaam juist tijdens deze periode van infectie wordt waargenomen en op een voldoende niveau blijft voor slechts een paar dagen. Na de 7e tot de 8e dag van de ziekte en vooral als het dier stierf om het virus te isoleren van het ingenomen materiaal is bijna onmogelijk.

2 Het materiaal moet vers zijn. Dit betekent dat het materiaal niet meer dan 1-2 uur duurt na het overlijden of de gedwongen slachting van het dier. Omdat de virustiter in weefsels na de dood van het dier snel wordt gereduceerd als resultaat van autolyse van weefsels en reproductie van micro-organismen.

3 Bij sterilisatie van het biomateriaal wordt steriliteit waargenomen. Hoe minder contaminatie van het materiaal door andere micro-organismen, hoe gemakkelijker het is om het echte veroorzakende agens van de infectie te detecteren en te isoleren.

4 Houd bij het nemen van biomateriaal rekening met het tropisme van het virus en selecteer die weefsels en organen waarin het virus zich in het lichaam reproduceert en zich opstapelt.

5 Afgenomen materiaal, als het onmogelijk is om het onmiddellijk in het blik in het laboratorium af te geven om de activiteit van het virus te behouden. Voor dit doel wordt het bevriezen van het biomateriaal het vaakst gebruikt of bewaard door een steriele oplossing van glycerine in 50% onder te dompelen.

De volledige volgorde van bemonstering van het patchmateriaal, de conservering en het transport voor specifieke virale infecties wordt geregeld door een speciale instructie van de Veterinary Legislation, Deel 2, blz. 155.

In het virologische laboratorium wordt het verkregen biomateriaal opgenomen en voorbereid voor onderzoek. Hiervoor wordt het gedrukt, ontdaan van bewaarmiddelen, gewogen en verdeeld in 2-3 porties (een deel van het materiaal wordt bewaard tot het einde van het onderzoek). Een deel van het materiaal wordt, indien nodig, gegeven voor bacteriologische en mycologische onderzoeken

Rekening houdend met de inhoud van het begeleidende document, wordt een studieplan opgesteld voor de virale infecties die daarin zijn aangegeven.

Er zijn drie gebieden van laboratoriumdiagnostiek van virale infecties:

1 Detectie van het virus of sporen van zijn aanwezigheid in het biomateriaal met behulp van uitdrukkelijke methoden.

2 Isolatie van het virus uit het biomateriaal en de identificatie ervan.

3 Retrospectieve serologische diagnose van virale infecties.

Het belangrijkste doel van laboratoriumonderzoek is om een ​​snel en nauwkeurig resultaat te verkrijgen, dus ik bestudeer het biomateriaal met ten minste twee methoden van verschillende richtingen.

Met de eerste methode kunt u een zo snel mogelijke reactie krijgen en de tweede methode (betrouwbaarder) zou het resultaat van de eerste moeten bevestigen. Deze methode van onderzoek geeft vertrouwen in de juistheid van het behaalde resultaat. En volgens dit resultaat van de laboratoriumstudie van het biomateriaal, wordt een definitieve diagnose gesteld voor een virale infectie.

Laten we in meer detail bekijken welke methoden zijn opgenomen in elke richting van laboratoriumdiagnostiek.

De eerste richting van de laboratoriumdiagnose zijn de uitdrukkelijke methoden

1 groep methoden maakt het mogelijk om genomen (nucleïnezuren) van virussen in het biomateriaal te detecteren. Dit is een methode van DNA-probes en polymerasekettingreactie (PCR). Meestal gebruikt u in de laboratoriumdiagnostica PCR. Op dit moment is deze reactie het meest gevoelig en specifiek, waardoor het mogelijk is om maximaal één molecuul van het nucleïnezuur van het virus te identificeren in absoluut elk onderzocht materiaal.

2-groep methoden maakt het mogelijk om virale antigenen in het biomateriaal te detecteren. Virussen hebben specifiek voor elk type eiwitten in het capside, supercapside (externe antigenen) en kern (interne antigenen). Daarom is het mogelijk om, met diagnostische specifieke sera of immunoglobulines voor bepaalde antigenen van het virus, het virus in het biomateriaal te detecteren met behulp van serologische reacties. De meest gevoelige hiervan zijn de immunofluorescentie-RIF (MFA) -reactie, de enzymimmunoassay is ELISA en de radioimmune analyse is RIA. Sluit de gevoeligheid van de RNGA. Minder gevoelig zijn de diffusie-precipitatiereactie - RDP, complementbindingsreactie - RBC en andere.

Alle reacties zijn gebaseerd op de interactie van specifieke antilichamen met homologe virale antigenen een antigen-antilichaam complex te vormen. Ontdek het complex op verschillende manieren. Dus in de RIF kleurstof luminescentie geassocieerd met specifieke antilichamen onder een fluorescentiemicroscoop in ELISA door de werking van het enzym gebonden aan het specifieke antilichamen in de RIA voor radioactieve straling isotoop gebonden antilichamen in IHA door agglutinatie van gesensibiliseerde (geladen) antilichamen erytrocyten in DTM precipitinelijn agarosegel, de verandering van RSC hemolytische, dat wordt toegevoegd aan het reactiemengsel, enzovoort.

RIF, IFA en RIA, RNGA zijn universeel, eenvoudig in de techniek van uitvoering, niet veeleisend voor steriliteit van het materiaal en laten toe resultaten binnen 2-4 uur te verkrijgen.

Het duurt ongeveer twee dagen voordat de RNC en de RDD een antwoord hebben gekregen, dus worden ze op dit moment minder vaak gebruikt. RSK voor het bepalen van het type mond- en klauwzeervirus, RDP bij de diagnose van hondsdolheid IRT van runderen, de pest van honden (zelfs rottend materiaal kan worden gebruikt).

4 methode is de detectie van virale hemagglutinines in het biomateriaal. Hemagglutinines zijn oppervlakte-receptoren van het virus, waardoor het kan worden geadsorbeerd op erythrocyten en ze aan elkaar kunnen lijmen. Identificeer dergelijke virussen door middel van de hemagglutinatiereactie (RGA).

Hemagglutiniserende activiteit van stammen van virussen is niet hetzelfde, andere niet. hemagglutinatie omstandigheden ook verschillend: de pH, temperatuur (4, 22, 37 C), bij aanwezigheid van Ca-ionen, natrium-magnesium soorten die erytrocyten (geslacht, leeftijd, fysieke conditie). Hemagglutinerende woningen in virussen stabieler zijn dan besmettelijk, zodat ze kunnen worden gemanifesteerd, zelfs wanneer het virus niet besmettelijkheid vertonen. RSA wordt gebruikt voor de detectie van biologisch materiaal in het influenza virus, parainfluenza virus, het virus IRT. Bijvoorbeeld: de verdeling van het influenza virus en het virus van de ziekte in het lichaam nyukaslskoy kippen en kuikens verschillend. Met de griep in de milt lever en longen van kippen en kippen vinden altijd veel hemagglutinine 1: 1024, terwijl voor Newcastle disease haemagglutinine slechts 20 eendagskuikens van 1: 128, en de kippen niet. Deze methode kan dus deze twee ziekten binnen 2 uur differentiëren.

De aanwezigheid van virale hemagglutininen wordt vaak gemaskeerd door de aanwezigheid van remmers van complexe samenstelling afkomstig van weefselcellen waarin het virus is vermenigvuldigd. Ze kunnen worden verwijderd door verwarming, behandeling met aceton, trypsine-ether, centrifugeren op hoge snelheid.

Maar vaak is in het biomateriaal de concentratie van het virus ontoereikend en daarom wordt deze reactie voornamelijk gebruikt na de accumulatie van het virus in het levende systeem.

De 5 groep methoden maakt het mogelijk om microscopie te gebruiken om virus virionen in het biomateriaal te detecteren. De eerste methode is een viroscopie - detectie van grote virussen onder een lichtmicroscoop na speciale kleuring, waarmee virionen kunnen worden verhoogd en gecontrasteerd. VIRUSOSCOPY wordt alleen gebruikt voor de diagnose van pokkeninfecties, omdat alleen het pokkenvirus onder een lichtmicroscoop kan worden gezien.

Virussen van andere virussen worden gedetecteerd onder een elektronenmicroscoop. Deze methode van de diagnose is vrij duur als het dure apparatuur, gespecialiseerd personeel en verfijnde trainingsmateriaal voor onderzoek vereist. Bovendien kan de morfologie van het virion alleen zijn familie bepalen, maar niet de soort. Daarom wordt deze methode op een beperkte manier toegepast. Echter, in sommige gevallen, is deze methode een sleutelrol bij de diagnose van bepaalde virale infecties, waarbij het virus is niet mogelijk om te isoleren of detecteren op een serologische test (parvovirus enteritis van honden), of wanneer u nodig hebt om snel te diagnosticeren (kroon-rota-virus infecties).

Het probleem met de identificatie van het virus onder de elektronenmicroscoop stelt ons in staat om het gebruik van specifieke antilichamen op te lossen. Elektronenmicroscopie met hun gebruik wordt immuno-elektronische microscopie genoemd. Preparaten voor microscopie worden behandeld met specifieke antilichamen tegen een specifiek type virus en bekeken onder een elektronenmicroscoop. In het positieve geval, als het virus en de antilichamen homoloog zijn, zullen de virionen omgeven door antilichamen zichtbaar zijn in het gezichtsveld.

fluorescentiemicroscopie werkwijze wordt niet alleen toegepast op de resultaten van IFA bekijken, maar ook voor de detectie van virus accumulatie in de cellen door eenvoudige fluorochroming laten verbeteren natuurlijke glans virus nucleïnezuren. Maar op deze manier is het mogelijk om alleen de groep van het virus te bepalen - DNA of RNA-bevattend.

6 methode is de detectie in cellen van weefsels van virale insluitsels. Intracellulaire insluitingslichamen worden gevormd in vele virale infecties en zijn specifiek voor elk type virus door structuur, locatie, kleur, etc. Daarom wordt deze methode gebruikt in onderzoeken naar rabiës, hondenpest, pokken en adenovirusinfecties.

Een groep van methoden is een bioassay en een immunologische test. Deze methoden worden ook wel uitdrukkelijke methoden genoemd, hoewel ze voorwaardelijk zijn vanwege hun duur (van 1 dag tot 30 dagen).

Een bioassay is een experimentele infectie met een patchmateriaal van een laboratorium of van nature gevoelige dieren. Het wordt gebruikt om de karakteristieke klinische en pathoanatomische symptomen voor deze virale ziekte weer te geven. De ziekte van Auezka wordt bijvoorbeeld gereproduceerd op konijnen, hondsdolheid bij muizen, mond- en klauwzeer bij cavia's, enz. Natuurlijk gevoelige dieren worden zelden gebruikt voor bioassays en alleen gevallen van reproductie van typische klinische tekenen van ziekte (schapenpokken, geiten, varkenspest, infectieuze anemie van paarden)

Immunologisch testen is een bioassay over immuun- en niet-immune organismen. Hiermee kunt u de ziekte differentiëren.

Bioprobo wordt vaak op proefdieren gelegd, maar dit garandeert niet altijd een nauwkeurig resultaat.

In het algemeen zijn alle bovenstaande snelle methoden is het mogelijk snel genoeg om te reageren op de aanwezigheid van het virus in het materiaal en de vorm, maar niet een hoge nauwkeurigheid van de meeste van de methoden, de basis vormen voor een definitieve diagnose te zetten en daarom moeten betrouwbaarder worden bevestigd.

In dit opzicht werken laboratoria samen met de snelle tests die worden uitgevoerd, indien mogelijk aan de tweede richting van laboratoriumdiagnostiek, die bestaat uit het isoleren en identificeren van het virus.

Isoleer het virus op een levend systeem. Om dit te doen, wordt een virale suspensie van het patomateriaal geïnfecteerd met laboratoriumdieren of kippenembryo's of een celkweek. Bij het kiezen van een levend systeem rekening houden met de gevoeligheid van haar om het virus, de diersoort vorm van biologisch materiaal, de voorlopige diagnose, het tropisme van het virus, etc. uitscheiden Bijvoorbeeld, als het materiaal wordt verkregen uit kippen ingeënt kippenembryo's, als zoogdieren, het infecteren van de kweek van cellen van hetzelfde type, als het virus infecteert het centrale zenuwstelsel wordt intracerebraal geïnfecteerd door te brengen, als de lever is dan intraperitoneale.. De tekenen van virus replicatie in het lichaam van proefdieren zijn de klinische symptomen, de dood en patologanatomicheskie izmenija in kippen embryo's dood, aandoeningen of hemagglutinerende eigenschappen extraembryonic vloeistof in celkweken of cytopatische effect YAV Lenie gemadsorbtsii. Aanpassing van het virus aan een levend systeem kan worden verlengd, dus besteed tot 4-5 blinde passages. Met een negatief resultaat van blinde passages wordt het onderzoek stopgezet, maar dit betekent niet dat er geen virale infectie is in het onderzochte dier. De reden kan een onjuiste opname en onjuiste overdracht van het biomateriaal zijn, waardoor het virus werd geïnactiveerd of er gewoon niet in zat.

Identificatie van het virus wordt uitgevoerd door de eigenschappen ervan te bestuderen. Bestuderen de structuur, de aanwezigheid van hemagglutinatie activiteit, het vermogen weergave van cytopathogeen effect in celkweek gemadsorbtsii. Natuurlijk, het bepalen van het type symmetrie van het aantal capsomeren, is de vorm van het virus onmogelijk binnen de praktische laboratoria. Daarom zijn er meer eenvoudige tests ontwikkeld, met behulp waarvan kan worden vastgesteld of een geïsoleerd virus tot een bepaalde familie behoort. Deze omvatten de grootte van het virion wordt geïnstalleerd door filtratie door filters met verschillende poriegroottes, het bepalen van gevoeligheid voor lucht, de stabiliteit bij pH 3,0, het gebruik van deoxyuridine derivaten onderdrukken reproductie alleen DNA-bevattende virussen en waardoor de aard van het nucleïnezuur van het virus te bepalen bestudeerd.

Maar het is alleen mogelijk om het type virus vast te stellen in serologische reacties met diagnostische sera. De keuze van de reactie hangt af van de eigenschappen van het virus en de mogelijkheden van het laboratorium. Dus de hemagglutinerende virussen worden geïdentificeerd in de RTGA, PGGAD, andere virussen in de RN, RNGA, RDP, DSC, MFA, ELISA.

Als de studies werden uitgevoerd op dezelfde soort dieren waarvan het biomateriaal werd genomen voor het onderzoek, en als dezelfde klinische symptomen werden waargenomen bij geïnfecteerde dieren, duidt dit op een positief resultaat van de onderzoeken. Isolatie van het virus op andere levende systemen is niet altijd een bewijs van de etiologie van de ziekte, vooral als het virus wordt geïsoleerd uit hun luchtwegen of darmen, waar asymptomatische virusdraging vaak aanwezig is. Bovendien kunnen vals-positieve resultaten worden verkregen in verband met de isolatie van latente virussen van dieren of van celkweken. In deze gevallen is het noodzakelijk om de etiologische rol van het geïsoleerde virus te bewijzen. Een van de methoden kan de reproductie van de ziekte zijn bij van nature vatbare dieren. Maar daarnaast is het duur, de ziekte kan niet worden gereproduceerd. Daarom, ongeacht de resultaten van dit gebied van laboratoriumdiagnose, worden studies in de derde richting uitgevoerd.

Tot de derde richting van laboratoriumdiagnostiek voeren serologische retrospectieve diagnostiek.

Retro (terug) betekent dat de diagnose van de afgelopen ziekte wordt uitgevoerd. Dit type diagnose omvat serologische studies van bloedserum van patiënten en zieke dieren op de aanwezigheid van antilichamen tegen het virus. Er moet rekening mee worden gehouden dat de positieve enkele studie, zelfs als er een hoge titer van antilichamen heeft geen diagnostische waarde. Een uitzondering kan een situatie zijn waarbij een geheel nieuw virus op het territorium verschijnt. De aanwezigheid van antilichamen in het bloed kan een gevolg zijn van een eerdere ziekte, een asymptomatische infectie of vaccinatie. Het positieve resultaat van een dergelijk onderzoek geeft alleen het contact van het dier met het virus aan, maar bepaalt niet wanneer het was. Serologische tests zijn van diagnostisch belang wanneer een toename van de titer van antilichamen tegen een specifiek virus wordt gedetecteerd. Hiervoor zijn de dieren twee monsters van bloedserum, de eerste keer het begin van de ziekte, en de tweede keer in 2- 3 weken bij al verdwijnen klinische ziektesymptomen. In beide sera wordt, met behulp van serologische reacties, de antilichaamtiter bepaald voor het vermoedelijke infectieuze agens. Als de antilichaamtiter toeneemt tot 4 of meer keer, bewijst dat het dierlijke organisme overgegaan infectieziekte die wordt veroorzaakt door het pathogeen waaraan het antilichaam werd bepaald in sera. Voor deze serologische onderzoeken zijn de meest gebruikte RN, IFA, RTGA, RNGA. De meest betrouwbare resultaten worden gegeven door PH, die het mogelijk maakt om virusneutraliserende antilichamen te detecteren, die verantwoordelijk zijn voor de bescherming van het lichaam tegen een virale infectie. Ondanks de retrospectieve diagnose, deze lijn van het virologisch onderzoek is van groot belang, geeft een idee van de omvang van de verspreiding van de infectie, de dynamiek van zijn manifestaties (toename of afname van het aantal seropositieve dieren) en stelt u in staat om effectieve maatregelen te nemen om de virale infectie weg te nemen, het uitvoeren van specifieke en algemene veterinaire-sanitaire maatregelen, zorgen voor een duurzaam welzijn van de economie in relatie tot een bepaalde virale infectie.

Serologische onderzoeksmethoden moeten op grote schaal worden gebruikt voor de evaluatie van postvaccinale immuniteit. Het is bekend dat de titer van postvaccinale antilichamen en het percentage seropositieve dieren voor een praktische dierenarts dient als een betrouwbare leidraad bij het beslissen of opnieuw te vaccineren. Op pluimveebedrijven wordt op dit moment de timing van de vaccinatie voor aviaire influenza bepaald op basis van de resultaten van systematisch serologisch onderzoek van 10-15% van het bestand. Soortgelijke "immuniteitsdiensten" moeten worden georganiseerd voor veehouderijbedrijven. Een dergelijke dienst zou de intensiteit van colostrale en postvaccinale immuniteit correct beoordelen en de timing van vaccinatie van alle groepen dieren plannen

Retrospectieve identificatie van de soorten en varianten van het virus van de vorige infectie is niet minder belangrijk voor specifieke preventie, en ook in het ecologische aspect maakt het mogelijk om het spectrum van interspecifieke circulatie van een bepaald virus te kennen.

De diagnose van elke virale infectie is dus alleen maar complex, gebaseerd op epizoötische, klinische, pathoanatomische en vooral laboratoriumstudies, die bepalend zijn voor de formulering van de uiteindelijke diagnose. Om een ​​snel en nauwkeurig resultaat van laboratoriumonderzoeken te verkrijgen, combineren verschillende methoden van verschillende virologische richtingen, waardoor men sterk kan geloven in de betrouwbaarheid van de onderzoeken.

Verstuur datum: 2015-07-23 | Weergaven: | Schending van het auteursrecht

38. Principes van laboratoriumdiagnose van virale infecties.

loading...

Laboratoriumstudies spelen een belangrijke rol bij de diagnose van infectieziekten, het voorschrijven van etiotrope therapie en het bewaken van de effectiviteit van de behandeling. Het proces van specifieke laboratoriumdiagnose is gebaseerd op het identificeren van de veroorzaker en de reactie van het menselijk lichaam tijdens het infectieuze proces. Het bestaat uit drie stappen: verzamelen van het materiaal, het transport (shpora№39), en zijn onderzoek in het laboratorium: 1) virologische methode omvat twee belangrijke stappen: de selectie van virussen en hun identificatie. Voor het isoleren van virussen worden celkweken, kippenembryo's en soms proefdieren gebruikt. De aanwezigheid van het virus in geïnfecteerde kweken wordt bepaald door de ontwikkeling van specifieke celdegeneratie, d.w.z. cytopathogeen effect, detectie van intracellulaire insluitingen en gebaseerd op de detectie van antigeen door immunofluorescentie positieve reacties gemadsorbtsii en hemagglutinatie. Virussen worden geïdentificeerd door immunologische methoden: hemagglutinatieremming, complementfixatie, neutralisatie, gelprecipitatie, immunofluorescentie. 2) Serologische reacties; 3) Immunologische methode (bioassays); 4) ELISA en PCR. Na ontvangst van de resultaten van de enquête en rekening houdend met de epizoötie en klinische gegevens, wordt een definitieve diagnose vastgesteld.

39. Pat. Nemen, voorbereiden en doorsturen. Het materiaal voor de viroloog. Research.

loading...

Het nemen, vervoeren en onderzoeken van pat. materiaal wordt gereguleerd door de veterinaire wetgeving. Wanneer rekening wordt gehouden met het tropisme van het virus - de voorkeurslocatie van het virus bij deze ziekte en pathogenese. Tijd om het schouderklopje te pakken. materiaal tot het einde van zijn studie - 2-4 uur. Als u meer tijd nodig heeft - ingeblikt (chemische methoden - 50% glycerine, fysisch bevriezend), maar niet voor luminescents. microscopie. Vervoer in het bijzonder. containers met begeleiders. document en koerier. De voorbereiding bestaat uit het extraheren van het virus uit de cellen. Vloeistof. materiaal - filtratie en centrifugatie. Voor zuivering van bacteriën - bacterieel. filters en antibiotica (500-2000 eenheden per 1 ml), van schimmels - fungiciden (25 eenheden per 1 ml), houd 30-40 minuten vast, maak gewassen voor een voeding. milieu (aerobes-MPA, MPB, NRM, anaerobes-Kitta-Tarozzi, paddestoelen-Chapeka, Saburo). Dicht patchmateriaal: 1) neem het patchmateriaal 1-1,5 g; 2) ze worden gemalen met een schaar; 3) rstirayut met steriel. glas of zand in een mortier; 4) 10% suspensie met de formule van Hens; 5) 2 keer bevroren en ontdooid; 6) filtratie door het gaasfilter; 7) centrifugatie (3000 rpm, 15 min); 8) Supernatant is een virusbevattend materiaal, het wordt gecontroleerd op bacteriën (medium), antibiotica en fungiciden worden toegevoegd.

40. Microscopische onderzoeksmethode in de virologie.

loading...

1.Svetovaya microscopie: 1) voor de detectie van variolavirus (verzilvering Werkwijze volgens Morozov); 2) Cellen detecteren van insluitingen (opeenhoping van delen van virionen of cellen of producten van de reactie op het virus, kunnen ze vnutriyaderye en cytoplasmatische zijn); 3) detectie van de CPD van het virus (afronding, fragmentatie, dood); 4) detectie van symplasten; 5) werken met C / K; 6) evaluatie van de seroloog. reacties (ELISA, RGAd, RTGAd).. 2.Lyuministsentnaya microscopie: kern - bestraling met UV-stralen aangeslagen atomen, vervolgens naar de begintoestand met energie vrijkomt als lichtemissie-intensiteit wordt geëvalueerd op kruisingen (Izumrud RG ++++ =; zel ++ =... +; zel geel = ++;. + geel = geen luminescentie = -).Voor bestraling kleurstofpreparaat fluorochromen (FITC, akredin oranje, geel, rhodamine).Dit tegen flyuorohromirovanie.. Ingewikkeld - MF.A.Sut MFA - specifiek. interactie van antilichaam met gemerkt fluorochroomserum (conjugaat). 3. Elektronenmicroscopie: 1) detectie van elk virus; 2) studie van de grootte, vorm, structuur, type symmetrie, reproductie; 3) onderzoek naar de interactie van het virus met de cel.

Principes van diagnose van virale infecties

loading...

Methoden voor de diagnose van virale infecties

loading...

Thema: "Methoden voor microbiologische diagnose van virale infecties. Preventie van virale infectie »

De student zou moeten weten:

-morfologie, ecologie, fysiologie van virussen, methoden van hun studie;

Inhoudsopgave:

-de basis van de epidemiologie van virale infecties (soorten infecties);

-basis van chemotherapie en chemoprofylaxe van virale infectie;

-immuniteitsfactoren bij virale infecties.

De student moet in staat zijn om:

-om de preventie van virale infecties uit te voeren;

-maak algoritmen voor actie in een epidemie.

Vragen voor een frontale discussie:

1. Geef het concept van virussen. Beschrijf de kenmerken van de structuur en de levensduur van het virusdeeltje.

2. Welke factoren beschermen het menselijk lichaam tegen het virus.

3. Noem de groep en het werkingsmechanisme van medicijnen tegen virussen. Geef voorbeelden van medicijnen.

4. Wat zijn de soorten infecties die door virussen worden veroorzaakt?

5. Benoem vertegenwoordigers van intestinale, bloed, respiratoire virale infecties, infecties van de huid en slijmvliezen.

6. Geef het concept "Epidemisch proces", beschrijf de structuur van de verspreiding van infecties onder de bevolking.

7. Noem, terwijl de acties die het epidemische proces liquideren worden genoemd.

Beschrijf de definities van methoden voor het bestuderen van virale infecties.

Zarisite in de intracellulaire inclusies van de atlas met een pokken (het lichaam van Gvarnieri), met hondsdolheid (het lichaam van Babesh-Negri).

3. Stel een plan op van anti-epidemische maatregelen voor een virale infectie (de infectie wordt bepaald door de leerkracht).

Korte theoretische proposities

Uitbreiding van de mogelijkheden voor de behandeling en preventie van virale ziekten met behulp van antivirale geneesmiddelen, immunomodulatoren en vaccins met verschillende werkingsmechanismen vereist snelle en nauwkeurige laboratoriumdiagnose. De nauwe specificiteit van sommige antivirale geneesmiddelen vereist ook een snelle en zeer specifieke diagnose van het infectieuze agens. Er was behoefte aan kwantitatieve methoden voor het bepalen van virussen voor het monitoren van antivirale therapie. Naast het vaststellen van de etiologie van ziekten, is laboratoriumdiagnostiek belangrijk bij het organiseren van anti-epidemische maatregelen.

Vroege diagnose van de eerste gevallen van epidemische infecties maakt een tijdige controlemaatregelen -. Quarantaine, ziekenhuisopname, vaccinaties, etc. De uitvoering van de afschaffing van de infectieziekte programma's, zoals pokken, heeft aangetoond dat zodra zij de rol van laboratorium diagnostiek. Het speelt een belangrijke rol in de laboratoriumdiagnostiek van bloedtransfusie diensten en verloskundige praktijk, bijvoorbeeld, de identificatie van donoren die besmet zijn met het human immunodeficiency virus (HIV), het hepatitis B-virus (HBV), rubella en cytomegalovirus infectie diagnose bij zwangere vrouwen.

Methoden voor de diagnose van virale infecties

Voor succesvolle isolatie van virussen, moet klinisch materiaal worden genomen in overeenstemming met de pathogenese van de vermeende ziekte en in de vroegst mogelijke tijd.

Neem in de regel:

- met luchtweginfecties - nasofaryngeale uitspoeling;

- met enterovirusinfecties - blozen en feces (rheo-, enterovirussen);

- met laesies van de huid en slijmvliezen - schraapsel, de inhoud van de blaren (herpes, waterpokken);

- met exanthemale infecties - opvliegers (mazelen, rodehond);

- met arbovirus-infecties - bloed, hersenvocht.

1. Snelle (express-methoden) - directe detectie van het virus of de componenten ervan (antigenen, NK), insluitsels rechtstreeks in het klinische materiaal.

A. Virousoscopische methode bestaat in de detectie van het virus in het testmateriaal onder een microscoop. De meest gebruikte elektronenmicroscoop. Lichtmicroscopie vanwege de verwaarloosbare grootte van virussen wordt praktisch niet gebruikt. Met deze methode kunt u het type NC, de grootte van het virion, de vorm van het virion bepalen en ook identificeren intracellulaire insluitsels, die worden gevormd in de aangetaste cellen met bepaalde infecties.

II. De virologische methode is gebaseerd op:

kweken gevoelige virussen in biologische systemen (celculturen van kippenembryo organismen proefdieren) waarin ze door de cytopathogene effect op het biologische systeem (1), identificeren door de remming van antivirale activiteiten virussen relevante antilichaam (Figuur 2).

Fig. 1. Cytopathisch effect van virussen op de cel: A-normale groei, B-CDD van virussen per cel

Fig.2 Remming van het virus door antilichamen

Virologisch onderzoek is de "gouden standaard" voor virologie en moet worden uitgevoerd in een gespecialiseerd virologisch laboratorium. Momenteel wordt het vrijwel alleen gebruikt in de context van een epidemische uitbraak van een bepaalde virale infectieziekte.

III. Serologische methode - de definitie van antivirale antilichamen (optimaal - IgM) en / of de bepaling van de dynamiek van de groei van hun titers gedurende een bepaalde periode van de ziekte in gepaarde sera. Diagnostische significantie wordt beschouwd als het verhogen van antilichaamtiter 4 en meer tijden.

De methode van gepaarde sera:we verzamelen veneus bloed in de hoeveelheid van 10 ml bij het begin van de ziekte en aan het einde bereiden we het serum voor, bepalen we het aantal antilichamen in het eerste en tweede serum.

In dit geval dient de viervoudige toename van de antilichaamtiter in het tweede serum in de meeste gevallen als een indicator voor de voortdurende of vers overgebrachte infectie. In de studie van één serum dat wordt ingenomen in de acute fase van de ziekte, is de detectie van antilichamen van IgM-klasse, indicatief voor acute infectie, van diagnostisch belang.

Moderne diagnostische methoden:

1. PCR-detectie van persistente virussen in NK, die in klinisch materiaal zijn en moeilijk te detecteren of niet detecteerbaar zijn met andere methoden.

2. Radio-isotoop immuunanalyse (RIA) -methode is gebaseerd op het label van antilichamen door radio-isotopen, die een hoge gevoeligheid leverden voor de bepaling van het virale antigeen. De methode werd veel gebruikt in de jaren tachtig, vooral om de markers van HBV en andere niet-cultiverende virussen te bepalen. De nadelen van de methode omvatten de noodzaak om te werken met radioactieve stoffen en het gebruik van dure apparatuur (gamma-tellers).

3. Immunoenzyme-analyse (ELISA) - Immunoenzymatische methoden voor het bepalen van virale antigenen zijn in principe vergelijkbaar met RIF, maar zijn gebaseerd op antilichaamlabeling met enzymen in plaats van met kleurstoffen. De meest gebruikte mierikswortelperoxidase en alkalische fosfatase, gebruikten ook b-galactosidase en b-lactamase. Gemerkte antilichamen binden aan het antigeen en dit complex wordt gedetecteerd door de toevoeging van een substraat voor het enzym waarmee de antilichamen zijn geconjugeerd. Het eindproduct van de reactie kan in de vorm zijn van een onoplosbaar precipitaat en vervolgens wordt de berekening uitgevoerd met behulp van een conventionele lichtmicroscoop, of als een oplosbaar product dat gewoonlijk gekleurd is (of fluoresceert of luminesceert) en instrumentaal wordt opgenomen.

Omdat oplosbare antigenen kunnen worden gemeten met ELISA, is er geen behoefte aan intacte cellen in het monster en dus kunnen verschillende soorten klinisch materiaal worden gebruikt.

Een ander belangrijk voordeel van de ELISA-methode is het vermogen om antigenen te kwantificeren, waardoor het kan worden gebruikt om het klinische verloop van de ziekte en de effectiviteit van chemotherapie te beoordelen. ELISA, evenals RIF, kunnen in zowel directe als indirecte versies worden gebruikt.

Solid-phase ELISA, die een oplosbaar gekleurd reactieproduct geeft, heeft de grootste verdeling gevonden. ELISA kan worden gebruikt om zowel het antigeen te bepalen (vervolgens op de vaste fase - de bodem van de putjes van polystyreenplaten - antilichamen worden toegepast), en om de antilichamen te bepalen (antigenen worden vervolgens op de vaste fase aangebracht).

4. Immunofluorescentie-reactie (RIF) - De methode is gebaseerd op het gebruik van antilichamen die aan de kleurstof zijn gebonden, bijvoorbeeld fluoresceïne-isothiocyanaat. De RIF wordt veel gebruikt voor het detecteren van virale antigenen in patiëntenmateriaal en voor een snelle diagnose.

In de praktijk worden twee versies van de RIF gebruikt: rechtdoor en indirect. In het eerste geval worden met kleurstof gemerkte antilichamen tegen virussen aangebracht die op geïnfecteerde cellen worden aangebracht (uitstrijkje, celkweek). Aldus verloopt de reactie in één stap. Het nadeel van de methode is de noodzaak om een ​​groot aantal geconjugeerde specifieke sera te hebben voor veel virussen.

Bij de indirecte uitvoeringsvorm FSI op het testmateriaal wordt aangebracht op een specifieke serumantilichamen die binden aan het virale antigeen in het materiaal, en dan gelamineerd antispecies serum gamma-globulinen van dieren, waarbij het bereiden van specifieke immunologische serum, zoals anti-konijn, antiloshadinaya en m. P. bezit indirecte versie van de RIF bestaat in de behoefte aan slechts één type gelabelde antilichamen.

De RIF-methode wordt veel gebruikt om snel de etiologie van acute respiratoire virale infecties te ontcijferen bij de analyse van uitstrijkjes - afdrukken van het slijmvlies van de bovenste luchtwegen. Het succesvolle gebruik van RIF voor directe detectie van een virus in een klinisch materiaal is alleen mogelijk als het een voldoende groot aantal geïnfecteerde cellen bevat en weinig contaminatie met micro-organismen die een niet-specifieke gloed kunnen geven.

5. Andere diagnostische methoden -

HAI gebruikt om ziekten die veroorzaakt worden hemagglutinatie virussen te diagnosticeren. Het is gebaseerd op de binding van serumantilichamen patiënt toegevoegde standaardoplossing virus. De indicator reacties zijn geagglutineerde erytrocyten virus (vorming kenmerk van de "paraplu") bij afwezigheid van antilichamen en afgezet op de bodem neagglyutinirovannymi indien aanwezig.

RSK is een van de traditionele serologische reacties en wordt gebruikt om vele virale infecties te diagnosticeren. Twee systemen nemen deel aan de reactie: serumantistoffen van de patiënt + standaardvirus en erytrocyten van de ram + antilichamen tegen hen, evenals getitreerd complement. Wanneer de antilichamen en het virus overeenkomen, bindt dit complex een complement en is er geen lyse van de lamserytrocyten (positieve reactie). Met negatief RNA-complement begunstigt het de lysis van rode bloedcellen. Het nadeel van de methode is de onvoldoende hoge gevoeligheid en de moeilijkheid om reagentia te standaardiseren.

Om rekening te houden met de significantie van RSK, evenals met RTGA, is het noodzakelijk de gepaarde sera te titreren, dat wil zeggen, genomen bij het begin van de ziekte en tijdens de reconvalescentieperiode.

RPGA is de agglutinatie van rode bloedcellen (of polystyreenballen) die met virale antigenen zijn gesensibiliseerd in de aanwezigheid van antilichamen. Op de erythrocyten kunnen alle virussen worden gesorbeerd, ongeacht de aanwezigheid of afwezigheid van hemagglutinerende activiteit in hen. In verband met de aanwezigheid van niet-specifieke reacties, worden sera bestudeerd in een verdunning van 1:10 of hoger.

RNGA is de agglutinatie van erytrocyten die zijn gesensibiliseerd met specifieke antilichamen in de aanwezigheid van virale antigenen. De grootste verdeling van RHPHA was in de detectie van HBs-antigeen in zowel patiënten als bloeddonoren.

Beginselen van de diagnose van virale infecties;

loading...

Voor de diagnose van virale infecties in laboratoria worden drie groepen methoden gebruikt:

1. Snelle (express) methoden - directe detectie van het pathogeen in klinisch materiaal (van de patiënt).

2. Virologische methode - isolatie van een virus uit een klinisch materiaal en de identificatie ervan.

3. Serologische methode - bepaling van de groei (dynamiek) van antilichamen tegen het virus (gedurende een bepaalde periode van de ziekte) in de gepaarde sera van de patiënt.

De keuze van de methode hangt af van de biologische eigenschappen van het virus, de periode

ziekte, evenals technische uitrusting van het laboratorium.

Snelle (express) methode. Het is gebaseerd op de snelle detectie en

Identificatie van het virus of de antigenen inclusies in biosubstrates (uitstrijkjes, biopsies, epitheel neerslag leukocyten, histologische secties profielmateriaal):

a) serologische methode - bepaling van viraal antigeen in het monster diagnostische antivirale sera in snelle reacties immunofluorescentie (IF), enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), een teller mmmunoelektroforez (WIEF), immuun elektronenmicroscopie (IEM) directe omzetting en omgekeerde passieve hemagglutinatie (PHA, ROPGA), omgekeerde passieve hemagglutinatie remming reactie (RTOPGA);

b) microscopische methode - detectie van elementaire deeltjes of insluitsels van virussen door middel van licht-, luminescentie- of elektronenmicroscopie:

c) moleculaire hybridisatie - hybridisatie van complementaire strengen van DNA of RNA (virus en probe).

Virologische methode. Gebaseerd op de teelt van virussen op

gevoelige celsystemen (celkweek, kippenembryo,

1. Hek van het bestudeerde materiaal.

2. Selecteren en verkrijgen van een gevoelig testsysteem, bepalen van de levensvatbaarheid ervan.

3. Infectie door het principe van cytotrophism.

4. Indicatie (detectie) van het virus.

5. De identificatie van het virus is gebaseerd op:

a) de bepaling van virusantigenen in het testsysteem met behulp van serologische reacties (IF, ELISA, RPGA, RTGA, RSK, PH, VIEF, enz.);

b) pathohistologisch onderzoek van organen en weefsels;

c) klinische symptomen;

d) biologische monsters (keratoconjunctival, enz.). Evaluatie van de methode: verwijst naar vroege hooggevoelige onderzoeksmethoden. Nadelen: de complexiteit van interpretatie van resultaten bij het isoleren van persistente virussen; technische complexiteit. De serologische methode. Het is gebaseerd op de groei van antilichaamtiter (winst) gedurende een bepaalde periode van de ziekte in gepaarde sera van patiënten of mensen die hersteld zijn - met behulp van een reeks virale diagnostieken. Gepaarde sera - twee sera van de ene patiënt bij het begin van de ziekte en na 1-4 weken. Serologische reacties (RPGA, RSK, RTGA, PH, ELISA, etc.) worden gelijktijdig met twee sera geplaatst om hun titers te bepalen en te vergelijken. Voor een vroege diagnose van de ziekte wordt de aanwezigheid van IgM in het serum (in indirecte IF en ELISA) bepaald.

PRINCIPES VAN DIAGNOSE VAN VIRALE INFECTIES

loading...

Voor laboratoriumdiagnostiek van virale infecties worden 3 groepen methoden gebruikt:

1. Snelle (express) methoden - directe detectie van het pathogeen in klinisch materiaal (van de patiënt).

2. Virologische methode - isolatie van een virus uit een klinisch materiaal en de identificatie ervan.

3. Serologische methode - bepaling van de groei (dynamiek) van antilichamen tegen het virus (gedurende een bepaalde periode van de ziekte) in de gepaarde sera van de patiënt.

De keuze van de methode hangt af van de biologische eigenschappen van het virus, de periode van de ziekte en de technische uitrusting van het laboratorium.

Express diagnose is gebaseerd op de snelle detectie en identificatie van virale antigenen of zijn indeling bij biosubstrates (uitstrijkjes, biopsies, epitheel neerslag leukocyten, histologische secties doorsnede materiaal).

a) serologische - bepaling van viraal antigeen in het monster diagnostische antivirale sera in snelle reacties immunofluorescentie (IF), enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), tegen immuno-elektroforese (WIEF), immuun elektronenmicroscopie (IEM), de omzetting van directe en omgekeerde passieve hemagglutinatie (PHA, ROPGA) omzetting remming omgekeerde passieve hemagglutinatie (RTPGA);

b) microscopische methode - Detectie van elementaire deeltjes of insluitsels van virussen door middel van licht, luminescente of elektronenmicroscopie;

c) moleculaire hybridisatie - hybridisatie van complementaire strengen van DNA of RNA (virus en probe).

Virologische diagnose is gebaseerd op de kweek van virussen op gevoelige cellulaire systemen (celcultuur, kippenembryo, laboratoriumdieren).

1. Hek van het bestudeerde materiaal.

2. Selecteren en verkrijgen van een gevoelig testsysteem, bepalen van de levensvatbaarheid ervan.

3. Infectie door het principe van cytotrophism.

4. Indicatie (detectie) van het virus.

5. Identificatie en typering van het virus vindt plaats op basis van:

a) bepaling van de antigenen van het virus in het testsysteem door middel van serologische tests;

(IF, IFA, RPGA, RTGA, RSK, RN, VIEF, enz.);

b) pathohistologisch onderzoek van organen en weefsels, zoals CPD;

c) klinische symptomen, biologische monsters (keratoconjunctival, enz.).

De methode verwijst naar vroege hooggevoelige onderzoeksmethoden.

Nadelen: de complexiteit van interpretatie van resultaten bij het isoleren van persistente virussen; technische complexiteit.

De serologische methode bepaalt de toename van de titer (toename van antilichamen) gedurende een bepaalde periode van de ziekte in de gepaarde sera van patiënten of mensen die hersteld zijn - met behulp van een reeks virale diagnostische gegevens.

Gepaarde sera - twee sera van de ene patiënt aan het begin van de ziekte en na 1-4 weken. Serologische reacties (RPGA, RSK, RTGA, PH, ELISA, etc.) worden gelijktijdig met twee sera geplaatst om hun titers te bepalen en te vergelijken. Voor vroege diagnose van de ziekte wordt de aanwezigheid van Ig M in één serum (in indirecte IF en ELISA) bepaald.

Principes en methoden voor diagnose van virale infecties

loading...

Het systeem van maatregelen ter bestrijding van virale infecties omvat: diagnose van behandeling en preventie.

Diagnose speelt een beslissende rol in het systeem van maatregelen ter bestrijding van ziekten van de virale etiologie

Diagnose (van het Griekse woord diagnose - herkenning) is een definitie van de aard en de essentie van de ziekte, de vaststelling van de oorzaak en vorm ervan. Het diagnoseproces wordt diagnostiek genoemd. Het bestaat uit drie fasen:

Fase 2 - analyse en evaluatie van onderzoeksresultaten

Fase 3 - conclusie over de oorzaak, vorm van de ziekte en de toestand van het zieke organisme.

Snel en correct gediagnosticeerd, is dit 50% succes in de strijd tegen een virale infectie, namelijk het stelt je in staat om gerichte maatregelen te nemen om het met het minste verlies te elimineren. Het uitbreken van een virale infectie kan worden vergeleken met een brand. Het eerdere "branden" wordt opgemerkt en hoe eerder het "blussen" werd gestart, hoe minder schade.

Voorbeeld: een pluimveebedrijf in de buurt van Leningrad in 1986 brak een ziekte uit Newcastle uit. De diagnose werd pas na 2 weken gesteld en was onjuist (voor de griep). Als gevolg van een verlate en onjuiste diagnose gingen 3 miljoen vogels verloren. Het voorbeeld laat zien dat het in handen is van dierenartsen die de economie van het land zijn. Daarom moet de diagnose van een virale ziekte zo snel mogelijk en zo nauwkeurig mogelijk worden gesteld.

Als een infectieziekte wordt vermoed, inclusief een virusdiagnose, wordt deze uitgebreid vastgesteld op basis van de volgende gegevens:

1 epizoötische gegevens

2 klinische onderzoeksgegevens

3 van deze pathoanatomische onderzoeken

4 laboratoriumgegevens

Tijdens het diagnosticeren worden twee fasen onderscheiden:

De eerste is klinisch-epizoötisch. Deze fase wordt direct op de plaats van de virusinfectie (in de boerderij, de kwekerij, de pluimveehouderij) uitgevoerd. Op basis van de verzamelde gegevens (epizoötisch, klinisch en pathoanatomisch) wordt een voorlopige diagnose gesteld.

De tweede is laboratoriumdiagnose. Het wordt uitgevoerd in een gespecialiseerde instelling - het virologisch laboratorium of de afdeling. Het voert een onderzoek uit naar het materiaal dat is verkregen uit de plaats van herkomst van de virale infectie en houdt rekening met de voorlopige diagnose. Op basis van de resultaten van laboratoriumtests wordt een definitieve diagnose voor een virale infectie vastgesteld.

De eerste fase begint met het verzamelen en bestuderen van epizoötische gegevens. Dit omvat informatie over de aanwezigheid van een virale infectie in het gebied en wat; over het aantal zieke dieren, hun type, leeftijd, geslacht, fysiologische toestand; over de seizoensgebondenheid van de ziekte, de aanwezigheid van vectoren en reservoirs van infectie, het contact van dieren met de bron van infectie; verspreidingssnelheid van de ziekte; over de komst van nieuwe dieren, herplaatsingen van dieren, vaccinaties en immuniteit. Zo wordt mond- en klauwzeer gekenmerkt door: gebruikelijk in het grensgebied aan de grens met het probleemgebied van deze ziekte treedt alleen evenhoevigen, snelle dekking van de populatie in een korte tijd kunnen vervoerders alle dieren en vogels en mensen, producten van dierlijke oorsprong, enz Klinisch onderzoek van patiënten te beginnen met dierlijke habitus (temperatuur, hartslag, ademhaling, lichaamshouding in de ruimte, temperament, grondwet, vetheid, enz.) En geschiedenis. Vervolgens wordt elk lichaamssysteem onderzocht, waarbij de afwijking van de normale toestand wordt vermeld.

Pathologische veranderingen worden vastgesteld bij de opening van de gevallen of gedwongen gedood dieren. De veranderingen in organen en weefsels worden genoteerd in vergelijking met de norm, de aanwezigheid van neoplasma's.

In een aantal gevallen zijn de klinische en morfologische veranderingen zo kenmerkend dat u een diagnose kunt stellen (pokken, mond- en klauwzeer). Vaak is de ziekte echter atypisch of worden er onmiddellijk tekenen van de ziekte waargenomen met verschillende infecties. Bovendien komen er onlangs gemengde infecties voor wanneer de ziekte niet door één wordt veroorzaakt, maar door twee of meer etiologische agentia (twee virussen of een virus en een bacterie).

Een ander voorbeeld, wanneer zelfs met een infectie als mond- en klauwzeer laboratoriumtests vereist zijn om het type en subtype te bepalen, aangezien immuniteit alleen beschermt tegen het type mond- en klauwzeervirus dat werd gevormd.

Daarom moet in alle gevallen een voorlopige diagnose worden bevestigd door laboratoriumtests.

Dus als gevolg van een klinische en epizoötologische analyse van honderd virusziekten, stopt de dierenarts bij 2-3 infecties en wijst ze op in een begeleidend document voor het biomateriaal dat naar het virologisch laboratorium wordt gestuurd.

De resultaten van laboratoriumonderzoeken zijn grotendeels afhankelijk van de juistheid van het nemen en verzenden van het biomateriaal (pathologisch) materiaal voor deze onderzoeken.

De basisvereisten voor het nemen en doorsturen van het biomateriaal zijn als volgt:

1 Het materiaal wordt genomen aan het begin van de klinische manifestatie van de virale ziekte. Omdat het maximale gehalte van het virus in de weefsels van het lichaam juist tijdens deze periode van infectie wordt waargenomen en op een voldoende niveau blijft voor slechts een paar dagen. Na de 7e tot de 8e dag van de ziekte en vooral als het dier stierf om het virus te isoleren van het ingenomen materiaal is bijna onmogelijk.

2 Het materiaal moet vers zijn. Dit betekent dat het materiaal niet meer dan 1-2 uur duurt na het overlijden of de gedwongen slachting van het dier. Omdat de virustiter in weefsels na de dood van het dier snel wordt gereduceerd als resultaat van autolyse van weefsels en reproductie van micro-organismen.

3 Bij sterilisatie van het biomateriaal wordt steriliteit waargenomen. Hoe minder contaminatie van het materiaal door andere micro-organismen, hoe gemakkelijker het is om het echte veroorzakende agens van de infectie te detecteren en te isoleren.

4 Houd bij het nemen van biomateriaal rekening met het tropisme van het virus en selecteer die weefsels en organen waarin het virus zich in het lichaam reproduceert en zich opstapelt.

5 Afgenomen materiaal, als het onmogelijk is om het onmiddellijk in het blik in het laboratorium af te geven om de activiteit van het virus te behouden. Voor dit doel wordt het bevriezen van het biomateriaal het vaakst gebruikt of bewaard door een steriele oplossing van glycerine in 50% onder te dompelen.

De volledige volgorde van bemonstering van het patchmateriaal, de conservering en het transport voor specifieke virale infecties wordt geregeld door een speciale instructie van de Veterinary Legislation, Deel 2, blz. 155.

In het virologische laboratorium wordt het verkregen biomateriaal opgenomen en voorbereid voor onderzoek. Hiervoor wordt het gedrukt, ontdaan van bewaarmiddelen, gewogen en verdeeld in 2-3 porties (een deel van het materiaal wordt bewaard tot het einde van het onderzoek). Een deel van het materiaal wordt, indien nodig, gegeven voor bacteriologische en mycologische onderzoeken

Rekening houdend met de inhoud van het begeleidende document, wordt een studieplan opgesteld voor de virale infecties die daarin zijn aangegeven.

Er zijn drie gebieden van laboratoriumdiagnostiek van virale infecties:

1 Detectie van het virus of sporen van zijn aanwezigheid in het biomateriaal met behulp van uitdrukkelijke methoden.

2 Isolatie van het virus uit het biomateriaal en de identificatie ervan.

3 Retrospectieve serologische diagnose van virale infecties.

Het belangrijkste doel van laboratoriumonderzoek is om een ​​snel en nauwkeurig resultaat te verkrijgen, dus ik bestudeer het biomateriaal met ten minste twee methoden van verschillende richtingen.

Met de eerste methode kunt u een zo snel mogelijke reactie krijgen en de tweede methode (betrouwbaarder) zou het resultaat van de eerste moeten bevestigen. Deze methode van onderzoek geeft vertrouwen in de juistheid van het behaalde resultaat. En volgens dit resultaat van de laboratoriumstudie van het biomateriaal, wordt een definitieve diagnose gesteld voor een virale infectie.

Laten we in meer detail bekijken welke methoden zijn opgenomen in elke richting van laboratoriumdiagnostiek.

De eerste richting van de laboratoriumdiagnose zijn de uitdrukkelijke methoden

1 groep methoden maakt het mogelijk om genomen (nucleïnezuren) van virussen in het biomateriaal te detecteren. Dit is een methode van DNA-probes en polymerasekettingreactie (PCR). Meestal gebruikt u in de laboratoriumdiagnostica PCR. Op dit moment is deze reactie het meest gevoelig en specifiek, waardoor het mogelijk is om maximaal één molecuul van het nucleïnezuur van het virus te identificeren in absoluut elk onderzocht materiaal.

2-groep methoden maakt het mogelijk om virale antigenen in het biomateriaal te detecteren. Virussen hebben specifiek voor elk type eiwitten in het capside, supercapside (externe antigenen) en kern (interne antigenen). Daarom is het mogelijk om, met diagnostische specifieke sera of immunoglobulines voor bepaalde antigenen van het virus, het virus in het biomateriaal te detecteren met behulp van serologische reacties. De meest gevoelige hiervan zijn de immunofluorescentie-RIF (MFA) -reactie, de enzymimmunoassay is ELISA en de radioimmune analyse is RIA. Sluit de gevoeligheid van de RNGA. Minder gevoelig zijn de diffusie-precipitatiereactie - RDP, complementbindingsreactie - RBC en andere.

Alle reacties zijn gebaseerd op de interactie van specifieke antilichamen met homologe virale antigenen een antigen-antilichaam complex te vormen. Ontdek het complex op verschillende manieren. Dus in de RIF kleurstof luminescentie geassocieerd met specifieke antilichamen onder een fluorescentiemicroscoop in ELISA door de werking van het enzym gebonden aan het specifieke antilichamen in de RIA voor radioactieve straling isotoop gebonden antilichamen in IHA door agglutinatie van gesensibiliseerde (geladen) antilichamen erytrocyten in DTM precipitinelijn agarosegel, de verandering van RSC hemolytische, dat wordt toegevoegd aan het reactiemengsel, enzovoort.

RIF, IFA en RIA, RNGA zijn universeel, eenvoudig in de techniek van uitvoering, niet veeleisend voor steriliteit van het materiaal en laten toe resultaten binnen 2-4 uur te verkrijgen.

Het duurt ongeveer twee dagen voordat de RNC en de RDD een antwoord hebben gekregen, dus worden ze op dit moment minder vaak gebruikt. RSK voor het bepalen van het type mond- en klauwzeervirus, RDP bij de diagnose van hondsdolheid IRT van runderen, de pest van honden (zelfs rottend materiaal kan worden gebruikt).

4 methode is de detectie van virale hemagglutinines in het biomateriaal. Hemagglutinines zijn oppervlakte-receptoren van het virus, waardoor het kan worden geadsorbeerd op erythrocyten en ze aan elkaar kunnen lijmen. Identificeer dergelijke virussen door middel van de hemagglutinatiereactie (RGA).

Hemagglutiniserende activiteit van stammen van virussen is niet hetzelfde, andere niet. hemagglutinatie omstandigheden ook verschillend: de pH, temperatuur (4, 22, 37 C), bij aanwezigheid van Ca-ionen, natrium-magnesium soorten die erytrocyten (geslacht, leeftijd, fysieke conditie). Hemagglutinerende woningen in virussen stabieler zijn dan besmettelijk, zodat ze kunnen worden gemanifesteerd, zelfs wanneer het virus niet besmettelijkheid vertonen. RSA wordt gebruikt voor de detectie van biologisch materiaal in het influenza virus, parainfluenza virus, het virus IRT. Bijvoorbeeld: de verdeling van het influenza virus en het virus van de ziekte in het lichaam nyukaslskoy kippen en kuikens verschillend. Met de griep in de milt lever en longen van kippen en kippen vinden altijd veel hemagglutinine 1: 1024, terwijl voor Newcastle disease haemagglutinine slechts 20 eendagskuikens van 1: 128, en de kippen niet. Deze methode kan dus deze twee ziekten binnen 2 uur differentiëren.

De aanwezigheid van virale hemagglutininen wordt vaak gemaskeerd door de aanwezigheid van remmers van complexe samenstelling afkomstig van weefselcellen waarin het virus is vermenigvuldigd. Ze kunnen worden verwijderd door verwarming, behandeling met aceton, trypsine-ether, centrifugeren op hoge snelheid.

Maar vaak is in het biomateriaal de concentratie van het virus ontoereikend en daarom wordt deze reactie voornamelijk gebruikt na de accumulatie van het virus in het levende systeem.

De 5 groep methoden maakt het mogelijk om microscopie te gebruiken om virus virionen in het biomateriaal te detecteren. De eerste methode is een viroscopie - detectie van grote virussen onder een lichtmicroscoop na speciale kleuring, waarmee virionen kunnen worden verhoogd en gecontrasteerd. VIRUSOSCOPY wordt alleen gebruikt voor de diagnose van pokkeninfecties, omdat alleen het pokkenvirus onder een lichtmicroscoop kan worden gezien.

Virussen van andere virussen worden gedetecteerd onder een elektronenmicroscoop. Deze methode van de diagnose is vrij duur als het dure apparatuur, gespecialiseerd personeel en verfijnde trainingsmateriaal voor onderzoek vereist. Bovendien kan de morfologie van het virion alleen zijn familie bepalen, maar niet de soort. Daarom wordt deze methode op een beperkte manier toegepast. Echter, in sommige gevallen, is deze methode een sleutelrol bij de diagnose van bepaalde virale infecties, waarbij het virus is niet mogelijk om te isoleren of detecteren op een serologische test (parvovirus enteritis van honden), of wanneer u nodig hebt om snel te diagnosticeren (kroon-rota-virus infecties).

Het probleem met de identificatie van het virus onder de elektronenmicroscoop stelt ons in staat om het gebruik van specifieke antilichamen op te lossen. Elektronenmicroscopie met hun gebruik wordt immuno-elektronische microscopie genoemd. Preparaten voor microscopie worden behandeld met specifieke antilichamen tegen een specifiek type virus en bekeken onder een elektronenmicroscoop. In het positieve geval, als het virus en de antilichamen homoloog zijn, zullen de virionen omgeven door antilichamen zichtbaar zijn in het gezichtsveld.

fluorescentiemicroscopie werkwijze wordt niet alleen toegepast op de resultaten van IFA bekijken, maar ook voor de detectie van virus accumulatie in de cellen door eenvoudige fluorochroming laten verbeteren natuurlijke glans virus nucleïnezuren. Maar op deze manier is het mogelijk om alleen de groep van het virus te bepalen - DNA of RNA-bevattend.

6 methode is de detectie in cellen van weefsels van virale insluitsels. Intracellulaire insluitingslichamen worden gevormd in vele virale infecties en zijn specifiek voor elk type virus door structuur, locatie, kleur, etc. Daarom wordt deze methode gebruikt in onderzoeken naar rabiës, hondenpest, pokken en adenovirusinfecties.

Een groep van methoden is een bioassay en een immunologische test. Deze methoden worden ook wel uitdrukkelijke methoden genoemd, hoewel ze voorwaardelijk zijn vanwege hun duur (van 1 dag tot 30 dagen).

Een bioassay is een experimentele infectie met een patchmateriaal van een laboratorium of van nature gevoelige dieren. Het wordt gebruikt om de karakteristieke klinische en pathoanatomische symptomen voor deze virale ziekte weer te geven. De ziekte van Auezka wordt bijvoorbeeld gereproduceerd op konijnen, hondsdolheid bij muizen, mond- en klauwzeer bij cavia's, enz. Natuurlijk gevoelige dieren worden zelden gebruikt voor bioassays en alleen gevallen van reproductie van typische klinische tekenen van ziekte (schapenpokken, geiten, varkenspest, infectieuze anemie van paarden)

Immunologisch testen is een bioassay over immuun- en niet-immune organismen. Hiermee kunt u de ziekte differentiëren.

Bioprobo wordt vaak op proefdieren gelegd, maar dit garandeert niet altijd een nauwkeurig resultaat.

In het algemeen zijn alle bovenstaande snelle methoden is het mogelijk snel genoeg om te reageren op de aanwezigheid van het virus in het materiaal en de vorm, maar niet een hoge nauwkeurigheid van de meeste van de methoden, de basis vormen voor een definitieve diagnose te zetten en daarom moeten betrouwbaarder worden bevestigd.

In dit opzicht werken laboratoria samen met de snelle tests die worden uitgevoerd, indien mogelijk aan de tweede richting van laboratoriumdiagnostiek, die bestaat uit het isoleren en identificeren van het virus.

Isoleer het virus op een levend systeem. Om dit te doen, wordt een virale suspensie van het patomateriaal geïnfecteerd met laboratoriumdieren of kippenembryo's of een celkweek. Bij het kiezen van een levend systeem rekening houden met de gevoeligheid van haar om het virus, de diersoort vorm van biologisch materiaal, de voorlopige diagnose, het tropisme van het virus, etc. uitscheiden Bijvoorbeeld, als het materiaal wordt verkregen uit kippen ingeënt kippenembryo's, als zoogdieren, het infecteren van de kweek van cellen van hetzelfde type, als het virus infecteert het centrale zenuwstelsel wordt intracerebraal geïnfecteerd door te brengen, als de lever is dan intraperitoneale.. De tekenen van virus replicatie in het lichaam van proefdieren zijn de klinische symptomen, de dood en patologanatomicheskie izmenija in kippen embryo's dood, aandoeningen of hemagglutinerende eigenschappen extraembryonic vloeistof in celkweken of cytopatische effect YAV Lenie gemadsorbtsii. Aanpassing van het virus aan een levend systeem kan worden verlengd, dus besteed tot 4-5 blinde passages. Met een negatief resultaat van blinde passages wordt het onderzoek stopgezet, maar dit betekent niet dat er geen virale infectie is in het onderzochte dier. De reden kan een onjuiste opname en onjuiste overdracht van het biomateriaal zijn, waardoor het virus werd geïnactiveerd of er gewoon niet in zat.

Identificatie van het virus wordt uitgevoerd door de eigenschappen ervan te bestuderen. Bestuderen de structuur, de aanwezigheid van hemagglutinatie activiteit, het vermogen weergave van cytopathogeen effect in celkweek gemadsorbtsii. Natuurlijk, het bepalen van het type symmetrie van het aantal capsomeren, is de vorm van het virus onmogelijk binnen de praktische laboratoria. Daarom zijn er meer eenvoudige tests ontwikkeld, met behulp waarvan kan worden vastgesteld of een geïsoleerd virus tot een bepaalde familie behoort. Deze omvatten de grootte van het virion wordt geïnstalleerd door filtratie door filters met verschillende poriegroottes, het bepalen van gevoeligheid voor lucht, de stabiliteit bij pH 3,0, het gebruik van deoxyuridine derivaten onderdrukken reproductie alleen DNA-bevattende virussen en waardoor de aard van het nucleïnezuur van het virus te bepalen bestudeerd.

Maar het is alleen mogelijk om het type virus vast te stellen in serologische reacties met diagnostische sera. De keuze van de reactie hangt af van de eigenschappen van het virus en de mogelijkheden van het laboratorium. Dus de hemagglutinerende virussen worden geïdentificeerd in de RTGA, PGGAD, andere virussen in de RN, RNGA, RDP, DSC, MFA, ELISA.

Als de studies werden uitgevoerd op dezelfde soort dieren waarvan het biomateriaal werd genomen voor het onderzoek, en als dezelfde klinische symptomen werden waargenomen bij geïnfecteerde dieren, duidt dit op een positief resultaat van de onderzoeken. Isolatie van het virus op andere levende systemen is niet altijd een bewijs van de etiologie van de ziekte, vooral als het virus wordt geïsoleerd uit hun luchtwegen of darmen, waar asymptomatische virusdraging vaak aanwezig is. Bovendien kunnen vals-positieve resultaten worden verkregen in verband met de isolatie van latente virussen van dieren of van celkweken. In deze gevallen is het noodzakelijk om de etiologische rol van het geïsoleerde virus te bewijzen. Een van de methoden kan de reproductie van de ziekte zijn bij van nature vatbare dieren. Maar daarnaast is het duur, de ziekte kan niet worden gereproduceerd. Daarom, ongeacht de resultaten van dit gebied van laboratoriumdiagnose, worden studies in de derde richting uitgevoerd.

Tot de derde richting van laboratoriumdiagnostiek voeren serologische retrospectieve diagnostiek.

Retro (terug) betekent dat de diagnose van de afgelopen ziekte wordt uitgevoerd. Dit type diagnose omvat serologische studies van bloedserum van patiënten en zieke dieren op de aanwezigheid van antilichamen tegen het virus. Er moet rekening mee worden gehouden dat de positieve enkele studie, zelfs als er een hoge titer van antilichamen heeft geen diagnostische waarde. Een uitzondering kan een situatie zijn waarbij een geheel nieuw virus op het territorium verschijnt. De aanwezigheid van antilichamen in het bloed kan een gevolg zijn van een eerdere ziekte, een asymptomatische infectie of vaccinatie. Het positieve resultaat van een dergelijk onderzoek geeft alleen het contact van het dier met het virus aan, maar bepaalt niet wanneer het was. Serologische tests zijn van diagnostisch belang wanneer een toename van de titer van antilichamen tegen een specifiek virus wordt gedetecteerd. Hiervoor zijn de dieren twee monsters van bloedserum, de eerste keer het begin van de ziekte, en de tweede keer in 2- 3 weken bij al verdwijnen klinische ziektesymptomen. In beide sera wordt, met behulp van serologische reacties, de antilichaamtiter bepaald voor het vermoedelijke infectieuze agens. Als de antilichaamtiter toeneemt tot 4 of meer keer, bewijst dat het dierlijke organisme overgegaan infectieziekte die wordt veroorzaakt door het pathogeen waaraan het antilichaam werd bepaald in sera. Voor deze serologische onderzoeken zijn de meest gebruikte RN, IFA, RTGA, RNGA. De meest betrouwbare resultaten worden gegeven door PH, die het mogelijk maakt om virusneutraliserende antilichamen te detecteren, die verantwoordelijk zijn voor de bescherming van het lichaam tegen een virale infectie. Ondanks de retrospectieve diagnose, deze lijn van het virologisch onderzoek is van groot belang, geeft een idee van de omvang van de verspreiding van de infectie, de dynamiek van zijn manifestaties (toename of afname van het aantal seropositieve dieren) en stelt u in staat om effectieve maatregelen te nemen om de virale infectie weg te nemen, het uitvoeren van specifieke en algemene veterinaire-sanitaire maatregelen, zorgen voor een duurzaam welzijn van de economie in relatie tot een bepaalde virale infectie.

Serologische onderzoeksmethoden moeten op grote schaal worden gebruikt voor de evaluatie van postvaccinale immuniteit. Het is bekend dat de titer van postvaccinale antilichamen en het percentage seropositieve dieren voor een praktische dierenarts dient als een betrouwbare leidraad bij het beslissen of opnieuw te vaccineren. Op pluimveebedrijven wordt op dit moment de timing van de vaccinatie voor aviaire influenza bepaald op basis van de resultaten van systematisch serologisch onderzoek van 10-15% van het bestand. Soortgelijke "immuniteitsdiensten" moeten worden georganiseerd voor veehouderijbedrijven. Een dergelijke dienst zou de intensiteit van colostrale en postvaccinale immuniteit correct beoordelen en de timing van vaccinatie van alle groepen dieren plannen

Retrospectieve identificatie van de soorten en varianten van het virus van de vorige infectie is niet minder belangrijk voor specifieke preventie, en ook in het ecologische aspect maakt het mogelijk om het spectrum van interspecifieke circulatie van een bepaald virus te kennen.

De diagnose van elke virale infectie is dus alleen maar complex, gebaseerd op epizoötische, klinische, pathoanatomische en vooral laboratoriumstudies, die bepalend zijn voor de formulering van de uiteindelijke diagnose. Om een ​​snel en nauwkeurig resultaat van laboratoriumonderzoeken te verkrijgen, combineren verschillende methoden van verschillende virologische richtingen, waardoor men sterk kan geloven in de betrouwbaarheid van de onderzoeken.

Datum van toevoeging: 3 | Weergaven: | Schending van het auteursrecht

Principes van diagnostiek van virale ziekten van dieren

loading...

1) 10. Moderne classificatie van virussen, cryptogrammen van virussen.

De moderne classificatie van virussen is universeel voor virussen van gewervelde dieren, ongewervelde dieren, planten en protozoa. Het is gebaseerd op de fundamentele eigenschappen van virionen, waarvan de criteria de basis vormen voor de moderne classificatie:

1. type nucleïnezuur (RNA of DNA), de structuur;

2. de aanwezigheid van de lipoproteïnebekleding;

3. strategie van het virale genoom;

4. de grootte en morfologie van het virion, het type symmetrie, het aantal capsomeren;

6. fenomenen van genetische interacties;

7. Ronde gevoelige gastheren;

8. Pathogeniteit, inclusief pathologische veranderingen in cellen en de vorming van

Op basis van deze kenmerken zijn virussen verdeeld in orders, families, subfamilies, geslachten en soorten. De indeling in families werd uitgevoerd volgens de criteria in de punten 1 en 2, de indeling in geslachten en soorten - op basis van de volgende kenmerken.

Een viruscryptogram is een gecodeerd record van hun eigenschappen.

Het bestaat uit vier paar tekens of symbolen:

-het eerste paar - het type nucleïnezuur ((R - RNA, D - DNA) en het aantal ketens (1,2);

-de tweede is de molecuulmassa van het nucleïnezuur (in miljoenen Daltons, als het gefragmenteerd is, dan wordt het teken geschreven?) en het percentage van zijn massa van het molecuulgewicht van het hele virion;

-een derde paar karakters beschrijft virion vorm (uiterlijk) en vormen de nucleocapside (S - bolvormig, U - langwerpig met evenwijdige zijden en afgeronde einde of einden, E - langwerpig met evenwijdige zijden en einden voor vierkante, X - complex);

-vierde paar beschrijft host type (A - actinomyceten, B - bacteriën, F - champignons, I - ongewervelde dieren, S - zaadplanten, V - vertebraten) en virus type transporter (O - zonder drager, Ac - mijten, A1 - witte vlieg, Au - folders).

Kenmerken van de familie van flavivirussen.

Flaviviridae - een familie van virussen die voornamelijk worden overgedragen door geleedpotigen (mijten en muskieten). De familie heeft zo'n naam gekregen van een virus met gele koorts (Engels. Geel koorts-virus, van de lat. flavus - geel). Gele koorts wordt op zijn beurt zo genoemd omdat het geelzucht veroorzaakt [2].

Flaviviridae werd in 1985 als een afzonderlijk gezin uit de Togaviridae-familie gekozen. De familie omvat de volgende geslachten:

· Flavivirus (kenmerkende soort - gele koortsvirus, West Nile-virus, dengue-virus, teken van encefalitis door teken) - omvat 53 menselijke en dierlijke virussen

· Hepacivirus - omvat het hepatitis C-virus en verschillende dierlijke virussen

· Pegivirus- omvat 2 soorten

· Pestivirus (kenmerkende soort - rundveediarree, klassiek koortsvirus of varkenspest) - omvat 4 virussen die zoogdieren infecteren maar geen mensen.

Het flavivirus-genoom wordt weergegeven door verschillende lineaire enkelstrengs (+) - RNA's met een lengte van 9,6 tot 12,3 duizend nucleotiden. Het 5'-uiteinde bevat een gemethyleerd nucleotide (5'-dop).

Virale deeltjes zijn bekleed met een schil, hebben een bolvorm en een diameter van ongeveer 40-60 nm.

Ziekten veroorzaakt door familieleden:

· West Nile Fever

Principe, lay-out, verdiensten en minpunten van de RIF en ELISA.

Voordelen van de RIF: hoge specificiteit en gevoeligheid; eenvoud van de techniek van het plaatsen; het minimum aantal componenten is vereist. Dit is een snelle diagnostische methode, want binnen een paar uur kun je een antwoord krijgen. Nadelen zijn onder meer subjectivisme bij het beoordelen van de intensiteit van gloeien en helaas zijn fluorescerende serums helaas van slechte kwaliteit. Momenteel wordt de RIF op grote schaal gebruikt bij de diagnose van virale ziekten van dieren.

Voordelen van ELISA: hoge gevoeligheid; specificiteit; eenvoud van de techniek van het plaatsen; een minimum aantal componenten is vereist; er zijn geen speciale instrumenten vereist; evaluatie kan visueel worden gedaan; de mogelijkheid van automatisering, waardoor het voor massaal onderzoek kan worden gebruikt; de sera in onderzoek vereisen geen voorbehandeling. Dit is een snelle diagnostische methode, want binnen een paar uur kun je een antwoord krijgen.

1) 39. Primaire-trypsinized, diploïde en transplanteerbare celculturen, hun eigenschappen en kenmerken.

Voor het eerst werden culturen in de jaren 50 gebruikt. Cellen op de kaart:

1) PRIMAIRE TRIPSINATED. Ze worden verkregen uit embryonaal weefsel, apen, enz. Tk wordt in een speciaal putmedium geplaatst, bevrijd van het morsen van onnodige elektrolyten, gemalen en vervolgens gegoten door de r-rum van trypsine in een vat. Plaats op een magnetische roerder, het vat wordt geschud. Daarna wordt gecentrifugeerd: het leven regelt en de dode drijft. Het supernatant met de dode  wordt afgetapt, het sediment wordt met medium gegoten, geschud en er wordt een suspensie verkregen, en vervolgens wordt de telling geteld in de Goryaev-kamer. Suspensies worden in een separator geplaatst en een speciaal groeimedium wordt toegevoegd, meer dan 1 ml medium moet  2 miljoen  zijn. Ze worden aan het oppervlak van het glas bevestigd, door het medium gewassen en beginnen zich te vermenigvuldigen, en bedekken het vat met MONOLITH. Vervolgens wordt het groeimedium afgetapt en toegevoegd ( sterft niet maar produceert niet) en VIRUSSEN en wordt 3-4 dagen gekweekt.

Als serum BLOOM aan het ondersteunende medium wordt toegevoegd, zit het PETWIN-eiwit, dat de voortplanting stimuleert (meestal in embryo's van runderen gebruikt), in de cyste, waarna een groeimedium wordt verkregen.

Voornamelijk getrypsiniseerde kweken worden ALLEEN 1 keer gebruikt.

VERPLAATST (IMMORTAL) zijn kankercellen: Hela, Hep-1, Hep-2 - werden verkregen in de jaren 50, toen werden ze constant opnieuw gesetteld. In dit geval giet uit het oude reageerbuisje het medium uit en voeg de VERSENE onder zijn invloed  af. Een suspensie van cellen met deze in-centrifuges,  bezinkt, verten wordt afgetapt en een putondersteunende oplossing wordt toegevoegd. Zo krijgen ze opnieuw een kant-en-klare cultuur.

Virussen in de celcultuur worden onthuld door hun cytopathische werking:

1) door hun vorming op een medium van continue (gasvormige) groei van celvrije "plaques"

2) op vacuolisatie van kweekcellen

3) het uiterlijk van cellulaire insluitsels

Ook gebruikte elektronenmicroscopie en serologische reacties

1) 16. Bereiding van een virusbevattend materiaal voor de studie.

In het laboratorium wordt het resulterende pleistermateriaal bevrijd van het conserveermiddel, ontdooid, gewassen uit glycerine, gewogen of gemeten. Een deel van het materiaal wordt gebruikt voor virologisch onderzoek, de rest wordt in de koelkast bewaard voor aanvullende onderzoeken. Vervolgens maken ze een plan voor het onderzoek van het verzonden materiaal.

Bereiding van organen en weefsels. Het virus moet worden vrijgemaakt uit de cellen van organen en weefsels en worden overgebracht naar een fosfaatbuffer of Hanks-oplossing. Om dit te doen, wordt het materiaal zorgvuldig gemalen met een schaar en gemalen in een mortier met steriel kwartszand. Van het gemalen materiaal wordt in het algemeen een 10% suspensie bereid op fosfaatbuffer of Hanks-oplossing. De resulterende suspensie wordt gecentrifugeerd in min. De supernatant wordt afgezogen in steriele flessen en bevrijd van microflora. Het is noodzakelijk onnodig grote doses antibiotica te vermijden, omdat hun overmaat bij verdere introductie in de celcultuur niet-specifieke degeneratie van de laatste kan veroorzaken. De voorkeur van verschillende doses antibiotica en de optimale wijze van centrifugeren in elk geval zijn aangegeven in de instructies voor de diagnose van de overeenkomstige virale ziekten. De blootstelling van de suspensie aan antibiotica is niet minder op kamertemperatuur, vervolgens wordt het materiaal onderworpen aan bacteriologische controle op de aanwezigheid van bacteriën, schimmels door inoculatie met MPA, MPB, MPBB en Saburo-medium. Na het verkrijgen van een negatief resultaat van bacteriologische controle, wordt het virusbevattende materiaal gebruikt om laboratoriumdieren, kippenembryo's of celculturen te infecteren. In het geval van positieve bacteriologische controle, wordt de suspensie van het virus onderworpen aan een aanvullende behandeling met antibiotica en wordt de controle opnieuw ingesteld. De suspensie wordt bewaard bij -20 ° C-minus 70 ° C.

Voorbereiding van afscheiding uit de neus, ogen. Tampons ondergedompeld in de juiste oplossing, schudden, zorgvuldig geperst, de resulterende vloeistof wordt gedurende 20 minuten bij 2-3000 minuten gecentrifugeerd. Het supernatant wordt afgezogen in een steriele buis en penicilline en streptomycine POED worden toegevoegd. per 1 ml, onderhouden en na bacteriologische controle gebruikt voor infectie. Van de celpellet worden uitstrijkjes voorbereid op de RIF.

Bereiding van feces. Kruk monster (ongeveer 1 g) werd in een pot met parels met 10 ml Hank's oplossing of fosfaatbufferoplossing. Na gemogenizatsii materiaal vortexen en daaropvolgende centrifugatie bij 2-3000 min. Gedurende 30 min, werd het supernatant afgezogen, toegevoegd penicilline, streptomycine eten. / ML, 30 eenheden nystatine. / Ml tetracycline en 200 ug per 1 ml. Posleminutnogo contact gezaaid pas steriliteit, ingevroren en opgeslagen bij -10 ° C - -20 ° C Op de dag van infectie van het testmateriaal wordt ontdooid en opnieuw gecentrifugeerd voor het verwijderen van de nieuw gevormde sediment na invriezen. Het ongebruikte materiaal wordt bevroren bewaard tot het einde van de test. Fecal kan worden vervangen door rectale uitstrijkjes, die minder verwerkingstijd nodig heeft, en de frequentie van virusisolatie niet alleen minder, maar soms ook hoger dan voor fecale studie. Urine werd behandeld met antibiotica (U / ml) en gebruikt voor de infectie. Content pukkels, blaasjes en puisten, schilfers en korstjes onderzocht op huiduitslag. Inhoud papels en blaasjes werd verdund met zoutoplossing 1: 5, en schillen, vlokken na wrijven gesuspendeerd in zoutoplossing 1: 5-1: 10 en gecentrifugeerd bij 2-3000 min techeniemin.. Na behandeling met penicilline en streptomycine (eten. / Ml), het materiaal van de infectie.

Voorbereiding van bloed. Om het virus te isoleren, kan een volledig ontvezeld of "lakewood" bloed of bloed met een anticoagulans worden gebruikt. Neem in het laatste geval 5 ml bloed in een reageerbuis met 5-6 druppels heparine en vries in. Na ontdooien wordt het hemolyseerde bloed gedurende 15 minuten bij 2-3000 minuten gecentrifugeerd, penicilline en streptomycine worden toegevoegd met een snelheid van ED / ml en na steriliteitstesten wordt het gebruikt voor infectie. Voor deze doeleinden is gecoaguleerd bloed ook geschikt. Het wordt gemalen in een mortier en er wordt een kleine hoeveelheid Hanks oplossing toegevoegd (1: 1 of 1: 2).

2) 64. Titer van het virus. Eenheid hoeveelheden virus (ooe, pfu, Gai, LD50 ELD50, ID50, EID50, TSPD50) \ virustiter -. Deze hoeveelheid virus in een volume-eenheid van materiaal. Aangezien de hoeveelheid virus niet kan worden uitgedrukt in gebruikelijke (volume, gewicht enz. N.) eenheden, plaats de meting eenheden maatregel of activiteitseenheden. Virussen hebben een infectieus en hemagglutinerend effect. Vandaar dat de eenheid van de hoeveelheid virus infecties en hemagglutinerende. LD50 is de dosering van virus die 50% van de proefdieren (meestal witte muizen) doodt; ID50 doses van virus dat klinische symptomen of pathologische aandoeningen in 50% van de geïnfecteerde proefdieren veroorzaakt, ELD - de dosering van virus die 50% van kippenembryo's doodt; EID50 -Dose virus pathologische veranderingen in 50% van de geïnfecteerde kippenembryo's; TSPD50- dosis virus die een cytopathisch effect bij 50% van de geïnfecteerde celculturen (buizen typisch met celkweken) veroorzaakt. Nummer ED50 (LD50 ID ELD50 of TSPD50 EID50) virus in een eenheidsvolume van virus-bevattende materiaal en de expressie titer (T) van het virus in dit materiaal. Bijvoorbeeld, T = 103,48 TSPD50 / 0,1 ml betekent dat elk 0,1 ml virus bevattend materiaal bevat 103'48 virus doses (m. E. meer dan 1000, maar minder dan namelijk 103,48 = 3020) waarvan elk in staat is een cytopathisch effect bij 50% van reageerbuizen met de kweek van cellen. bekende werkwijzen voor het bepalen van de hoeveelheid virus in het materiaal door lokale schade in geïnfecteerde celkweken en chorio- allantoïsche shell (HAO) kippenembryo's waarin de hoeveelheid virus in aanmerking pfu eenheden (PFU), eenheideenheden (OOE). Het gebruik van werkwijzen moeilijk te wijten aan het feit dat bij hoge concentraties van virus in het materiaal mogelijk is om fusie plaques voorkomen en het onmogelijk respectievelijk kwantificeren, [4]. De werkwijze wordt uitgevoerd met een levend virus is moeizaam en langdurig uitvoering (72-96 uur).

Equine influenza of influenza, - acute zeer besmettelijke virusziekte gemanifesteerd depressie, hyperthermie (koorts), tranenvloed, hoesten, hyperemie en oedeem van de slijmvliezen van de ogen, neus en de luchtpijp. De paarden van alle leeftijden zijn ziek. De oorzaak van de ziekte zijn virussen van de familie van orthomixovirussen van het geslacht Influent. Er werd vastgesteld dat van nature voorkomt virussen uitwisseling tussen mens en paard, en het paard griep virus is in staat om de barrière te overwinnen en veroorzaken infecties bij mensen. De manifestatie van paardeninfluenza bij mensen varieert echter van asymptomatisch tot klinisch zwak. Er is ook de relatie tussen influenzavirussen van paarden en sommige soorten van het griepvirus ptits.Osnovnoy bron van besmetting van de ziekteverwekker - zieke of zieke dieren. Het virus wordt uitgescheiden in de externe omgeving met een neusgeheim van geïnfecteerde personen tijdens een hoest. Indirecte overdracht van de microbe met voedsel, water en verzorgers is ook mogelijk. De snelle verspreiding van het virus in de kudde vergemakkelijkt de aanwezigheid van niet-geïmmuniseerde paarden De incubatietijd van de ziekte is 5-7 dagen. Griep manifesteert zich plotseling. Dieren staan ​​doelloos in de kraampjes, in de meeste gevallen weigeren ze het voer, hun haar is verward. Vervolgens werd de lichaamstemperatuur stijgt tot 40-41 ° C en kan worden opgeslagen gedurende verscheidene dagen, is er een intermitterend, frequente hoesten (waargenomen binnen 2-10 dagen), rollen in de droge, scherpe, frequente en pijnlijke. Patiënten paarden neusslijmvlies steenrode kleur, duidelijke afscheiding uit de neus en glaz.Perebolevshie dieren verwerven immuniteit tegen herinfectie met hetzelfde type virus ten minste één jaar. Veulens worden gevaccineerd passieve immuniteit materey.Diagnoz is op basis van klinische en laboratoriumgegevens epizootologicheskih krovi.Lechenie onderzoek is gedragingen geïnhaleerd met terpentijn, 2% natriumbicarbonaatoplossing, en andere gewassen. Complication gebruik sulfonamiden, antibiotica (b.v., benzylpenicilline eten in 5 ml 0,5% novocaïne oplossing, 2 maal per dag), chemotherapeutische geneesmiddelen (amantadine en de derivaten daarvan) en symptomatische behandelingen. Aanbevolen autohaemotherapy (inleiding bloed) subcutaan met 60 ml bloed, herhalende 2-3 dagen bij toenemende doses van 20 influenza ml.Profilaktika paarden optimale omstandigheden en voeden, quarantaine nieuwkomers individuen geïnactiveerd formolvaktsin toegediend creëren (immuniteit van hen is niet langer dan 4-6 maanden). Zieke paarden zijn geïsoleerd, vrij van werk en opleiding, voorzien van licht verteerbaar voedsel en warm water. Zieke dieren raken geleidelijk betrokken bij het werk. Pathogenese. Lichte paarden hebben structurele kenmerken die gedeeltelijk de aard van laesies in virale ademhalingsaandoeningen bepalen. Influenzavirussen hebben een uitgesproken tropisme voor luchtwegepitheel, cilinderepitheel cellen in het bijzonder van de inferieure turbinate en de luchtpijp. Het virus dringt ertussenin in en wordt intensief gereproduceerd, wat leidt tot dystrofie, necrose en afvallen van het epitheel. Beschadigd slijmvlies wordt doorlaatbaar voor virussen, het onderliggende weefsel met het vasculaire netwerk is betrokken. Als gevolg van celvernietiging ontwikkelt zich reactieve ontsteking, die echter verdere vooruitgang van de infectie niet voorkomt. De werkwijze strekt de onderste luchtwegen: ontwikkelen erosieve bronchitis, peribronhit, periarteriitis, bronchopneumonie. Er kunnen laesies en andere organen zijn - myocarditis, encefalopathie. Hoewel influenzavirussen vrij snel worden vernietigd in het lichaam, giftige stoffen, celafval, bacteriën, overhaast de bloedstroom, waardoor een mogelijke congestie, stasis, bloeding. Significante aandoeningen van coagulatie en fibrinolytische systemen verergeren de ontwikkeling van hemorrhagisch syndroom. Synergisme van deze processen verbetert proteolytische en cytotoxische activiteit van het virus, afbraak capillaire wanden veralgemening van infectie, pneumonie ontwikkeling afvoer met longoedeem. Het uit de cellen komende virus beïnvloedt nieuwe gebieden van het epitheel en een groot oppervlak van het slijmvlies is betrokken bij het pathologische proces. Met een zwakke resistentie van het macroorganisme ontwikkelt zich een secundaire infectie waarbij verschillende bacteriën betrokken zijn. Vanwege intoxicatie kan foetale dood optreden bij veulens. In reactie op de vermenigvuldiging van influenzavirus met specifieke immuunreacties van het lichaam, die door lokale antilichamen tegen het virus, die een hoofdrol in het beschermen van het lichaam met influenza-infectie spelen.

1) 40. Werkwijze voor de bereiding van de kweek van fibroblastcellen van kippenembryo's.

Celkweken worden verkregen niet alleen door de organen van embryo's, maar ook van de lichamen van verschillende jonge geslachte dieren, maar de aanpassing van de embryonale cellen om kunstmatige media reproductiesnelheid en hun gevoeligheid voor verschillende virussen significant hoger dan die van cellen die afkomstig zijn van jonge en volwassen dieren.

Vaak worden in de dierenartspraktijk 9-10 dagen oude kippenembryo's (CE), embryo's van konijnen, muizen, cavia's, verschillende landbouw- en huisdieren gebruikt om de CC te bereiden. In de medische virologie zijn de meest algemeen gebruikte verschillende getransfecteerde cellijnen en celculturen van menselijke embryofibroblasten. Dit materiaal is erg goedkoop, steriel en altijd in voldoende hoeveelheid beschikbaar in de gynaecologische afdelingen van kraamklinieken, na zwangerschapsafbreking bij vrouwen.

De ontdekking van in vitro kweken van dierlijke cellen methode werd voorafgegaan door vele jaren van exploratie en ontwikkeling van het kweekmedium voor de productie van low-cost recept laboratorium model voor de teelt van virussen die zou kunnen vervangen CE, laboratorium en boerderijdieren. Prioriteit in deze zaak is van Amerikaanse wetenschappers. In 1943 GODU Herang in 1949 GODU Endres studeerde stadia van de degeneratie van de cellen door het virus vervolgens cytopathisch effect (CPE) genoemd. Levende en dode cellen zijn duidelijk zichtbaar in een conventionele lichtmicroscoop, zelfs bij een lage vergroting. In 1952, Amerikaanse onderzoekers Dulbecco en Vogt ontwikkelde een methode voor het verkrijgen van primaire kweken van cellen getrypsiniseerd, die brede praktische toepassing laboratories medische en veterinaire virologie Biokombinat, biofactories en andere instellingen direct ontvangen.

Celkweken worden gebruikt voor:

1. Detectie van het virus in het onderzochte pathologische materiaal op de CPD.

2. Identificatie van het virus, de detectie van specifieke antilichamen in de onderzochte bloedserums en de bepaling van hun titers uit de neutralisatiereactie op de CC.

3. Accumulatie van het virus voor de productie van levende kweken en gedode virusvaccins.

4. Verkrijgen van virale antigenen-diagnostieken voor serologische diagnostiek van virussen

1) 31. Defecte storende deeltjes, het mechanisme van vorming, eigenschappen, betekenis.

Vermogen om interferentie die defectieve interfererende deeltjes te voorkomen verspreiding van besmettelijke homologe virus, dat voor hen een helpervirus. DI-deeltjes gebruiken voor hun reproductie de producten van de genen van het infectieuze virus en remmen daarmee specifiek de voortplanting ervan. Het vermogen van DI-deeltjes tot zelfverrijking komt met name duidelijk tot uiting in de seriële passage van een virus met een hoog aantal infecties. Met onverdund virus inoculum door seriële passages in vivo of in vitro, de beste methode voor het verzamelen van DI-deeltjes, en de toepassing van de verdunde inoculum om hun concentratie te reduceren tot een minimum en verbetering van de opbrengst van infectieuze virusayuDefektnye interfererende deeltjes gevonden in vrijwel alle dierlijke virussen (behalve pokkenvirussen). Opgemerkt moet worden dat auto-interferentie veroorzaakt door DI-deeltjes in picornavirussen slecht tot uitdrukking wordt gebracht. Het storende vermogen van DI-deeltjes kan afhangen van het type celculturen. DI-deeltjes spelen een rol bij infectie en immuniteit. Zij kunnen de natuurlijke virale infectie als gevolg van interferentie met infectieuze homologe virus te verzwakken en de invloed op het opzetten en onderhouden van persistente infectie in vivo en in vitro. Het hoge gehalte aan DI-deeltjes in levende vaccins kan de effectiviteit beïnvloeden.

1) 32. Celreactie op een virale infectie.

Infectie van de cel met virussen begint met de adsorptie van het virus op het celmembraan, dat optreedt als gevolg van de interactie van de oppervlakte-eiwitten van het virus met de membraanreceptoren van de cel. Verschillende virussen gebruiken verschillende cellulaire receptoren om te binden aan het celmembraan De temperatuur heeft in de regel weinig effect op de adsorptie van virussen (bij 4 ° C en bij 37 ° C is de snelheid van dit proces bijna hetzelfde). De binding van virussen aan membraanreceptoren beschermt het virus niet tegen neutralisatie met antilichamen.

Geadsorbeerde virussen komen de cel binnen met endocytose of door fusie met het celmembraan. Eenmaal in het cytoplasma komen virussen vrij uit de meeste eiwitten (stripvirussen) en start met repliceren. Penetratie in de cel, striping en reproductie van virussen hangt af van de intensiteit van het energiemetabolisme van de cel en de biochemische veranderingen die optreden in het celmembraan en het cytoskelet. Dus, bij temperaturen onder 37 ° C, vertraagt ​​de penetratie van virussen in de cel.

De triggerfactor voor het virus om de cel binnen te gaan is meestal binding van sommige oppervlakte-eiwitten van het virus aan de membraanreceptoren van de cel. Deze eiwitten worden op het oppervlak van het virus vertegenwoordigd door ten minste een paar moleculen en het aantal membraanreceptoren bereikt meestal enkele honderden.

Op het contactpunt van het virus met het celmembraan is er aggregatie van receptoren, die het mechanisme van intracellulaire signaaloverdracht triggert en veranderingen in het celmembraan stimuleert. De adsorptie van het virus wordt gewoonlijk door de cel waargenomen als de aanhechting van een "normaal" ligand aan de overeenkomstige receptor.

De adsorptie van veel virussen veroorzaakt endocytose, die begint met de formatie op het membraan van omboorde putten bedekt met clathrine. Vervolgens worden endosomen gevormd, waarin virussen het cytoplasma binnenkomen. Deze methode van penetratie in de cel is typerend voor picornavirussen, influenzavirussen en adenovirussen. De daaropvolgende fusie van virussen met het endosoommembraan wordt gestimuleerd door een afname van de pH in het endosoom.

Het effect van de pH op het penetratieproces is goed bestudeerd in het influenzavirus. Bij de adsorptie van deze virussen, receptoraggregatie en endocytose, wordt een belangrijke rol gespeeld door hemagglutinines van de buitenste schil. Conformationele veranderingen in hemagglutinine die optreden bij lage pH in het endosoom leiden tot het ontstaan ​​van amfifiele domeinen op het oppervlak van het molecuul, wat leidt tot de fusie van de buitenste envelop van het virus en het endosomale membraan.

Op moleculair niveau zijn de processen van fusie met het membraan en het verwijderen van de meeste virussen slecht begrepen. Als gevolg van de fusie verschijnen de lipiden en eiwitten van de buitenste omhulling van het virus met de lipiden en eiwitten van het celmembraan en komt het nucleocapside van het virus in het cytoplasma.

Complexe virussen in adsorptie en fusie met het celmembraan kunnen consequent verschillende eiwitten van de externe virale envelop omvatten. Er zijn gegevens dat de mechanismen van adsorptie van virussen en hun penetratie in de cel niet hetzelfde zijn in verschillende weefsels of op verschillende oppervlakken van epitheliale cellen.

1) 34.Verkrijging van virussen in het lichaam van dieren. gnotobiots, gnotophores. Lineaire spf-dieren.

Voor de kweek van virussen worden celkweken, kippenembryo's en gevoelige proefdieren gebruikt. Deze zelfde methoden worden ook gebruikt voor het kweken van rickettsia en chlamydia - obligate intracellulaire bacteriën, die niet op kunstmatige voedingsmedia groeien.

Celkweken Celkweken worden bereid uit dierlijk of menselijk weefsel. Culturen zijn verdeeld in primaire (niet-transplanteerbare), semi-getransponeerde en transplanteerbare.

Bereiding van primaire celkweek bestaat uit verschillende opeenvolgende stappen: verscheuren het weefsel scheiden van cellen door trypsinisatie, wassen resulterende homogene suspensie van cellen geïsoleerd uit trypsine, gevolgd door suspenderen cellen in een voedingsmedium verschaffen hun groei, zoals 199 medium aangevuld met runderserum.

Getransplanteerde culturen in tegenstelling tot de primaire, zijn ze aangepast aan de omstandigheden die hun permanente bestaan ​​in vitro verzekeren en blijven ze bestaan ​​voor enkele tientallen passages.

Getransplanteerde monolaag celkweken bereid uit normale en maligne cellijnen, met de mogelijkheid om voortdurend prolifereren in vitro bepaalde voorwaarden. Deze omvatten kankercellen HeLa, oorspronkelijk geïsoleerd uit een cervixcarcinoom, HEp-3 (vanaf lymfoïde cell carcinoma) en normale cellen van menselijke amnion, aap nier, en anderen.

Om culturen te transplanteren omvatten diploïde cellen van mensen. Ze vertegenwoordigen een cellulair systeem dat in een proces van 50 passages (tot een jaar) een diploïde set chromosomen behoudt, typisch voor de somatische cellen van het gebruikte weefsel. Humane diploïde cellen ondergaan geen kwaadaardige degeneratie en verschillen dus gunstig van tumorcellen.

Over de reproductie (reproductie) van virussen in de celcultuur beoordeeld door cytopathische werking (CPD), die microscopisch kan worden gedetecteerd en wordt gekenmerkt door morfologische veranderingen in cellen.

De aard van de CPD van virussen wordt zowel voor hun detectie (indicatie) als voor indicatieve identificatie gebruikt, d.w.z. voor het bepalen van de identiteit van hun soort.

Een van de methoden de indicatie van virussen is gebaseerd op het vermogen van het oppervlak van de cellen waarin ze worden gereproduceerd, om rode bloedcellen te adsorberen - de hemadsorptiereactie. Om het in de cultuur van met virussen geïnfecteerde cellen te brengen, voegt u een suspensie van erythrocyten toe en na enige tijd van contact worden de cellen met een isotone natriumchlorideoplossing gewassen. Gekleurde rode bloedcellen blijven op het oppervlak van met virus geïnfecteerde cellen.

Een andere methode is de hemagglutinatiereactie (RG). Het wordt gebruikt voor het detecteren van virussen in de kweekvloeistof van een celkweek of een chorion-middel of vruchtwater in een kippenembryo.

Het aantal virusdeeltjes wordt bepaald door titratie volgens de CPD in celcultuur. Om dit te doen, worden de kweekcellen geïnfecteerd met tienvoudige verdunning van het virus. Na een incubatie van 6-7 dagen worden ze onderzocht op de aanwezigheid van een CPD. De meeste verdunning wordt genomen voor de virustiter, die CPD veroorzaakt in 50% van de geïnfecteerde kweken. De titer van het virus wordt uitgedrukt door het aantal cytopathische doses.

Een meer accurate kwantitatieve methode voor het verantwoorden van individuele virusdeeltjes is de plaque-methode.

Sommige virussen kunnen worden gedetecteerd en geïdentificeerd door insluitsels, die ze vormen in de kern of het cytoplasma van geïnfecteerde cellen.

Kippenembryo's embriony.Kurinye vergeleken met celkweken minder verontreinigd met virussen en mycoplasma's, en ook relatief hoge vitaliteit en weerstand tegen verschillende invloeden.

8-12 dagen kippenembryo's worden gebruikt om zuivere kweken van rickettsia, chlamydia en een aantal virussen te verkrijgen voor diagnostische doeleinden, evenals voor de bereiding van een verscheidenheid aan geneesmiddelen (vaccins, diagnostica). De vermenigvuldiging van deze micro-organismen wordt beoordeeld aan de hand van de morfologische veranderingen die zijn onthuld na het openen van het embryo op de membranen.

Over de reproductie van sommige virussen, bijvoorbeeld influenza, pokken, kan worden beoordeeld op de hemagglutinatiereactie (RGA) met kip of andere erytrocyten.

De nadelen van deze techniek omvatten het onvermogen om de test-organisme te detecteren zonder voorafgaande ontleding van het embryo en de aanwezigheid van een groot aantal eiwitten en andere verbindingen die daaropvolgende zuivering Rickettsia of virussen belemmeren de productie van verschillende preparaten.

Laboratoriumdieren De specifieke gevoeligheid van dieren voor een specifiek virus en hun leeftijd bepalen het reproductievermogen van virussen. In veel gevallen zijn alleen pasgeboren dieren gevoelig voor een bepaald virus.

2) 59. Klassen van lymfocyten, de differentiatie in T- en B-lymfocyten kletki.Klassy. In de 60 jaar zijn vastgesteld, twee hoofdklassen van lymfocyten: T-cellen die zich ontwikkelen in de thymus, zijn verantwoordelijk voor letochny immuniteit en B-cellen, die onafhankelijk van de thymus ontwikkelen, zijn verantwoordelijk voor enkele van antiteloproduktsiyu.Odnako T-cellen spelen een belangrijke rol in de regulering van immuniteit en fungeren als assistent B-cellen in de humorale otveta.T lymfocyten voortkomen uit voorlopercellen, dispergeren van het beenmerg naar de thymus.

Na voltooiing van de differentiatie migreren T-lymfocyten naar de lymfeknopen en milt, waar ze zich vermenigvuldigen onder invloed van het antigeen. Ze circuleren constant met bloed en lymfe en penetreren bijna alle weefsels van het lichaam. T-lymfocyten, die reageren op het antigeen, beginnen te transformeren in blastcellen en klonaal vermenigvuldigen. In dit geval hebben ze duidelijk uitgesproken immunologische functies. Het zijn effectieve cellen die de functies van cellulaire immuniteit vervullen.Volgens de functionele eigenschappen zijn T-cellen onderverdeeld in vier categorieën:

1. T-cellen-helpers voeren een bepaalde immunologische functie uit bij de ontwikkeling van gammoral immuniteit als gevolg van samenwerking met B-lymfocyten. Een dergelijke interactie van cellen bevordert de reproductie van een kloon van B-lymfocyten en intensieve productie van antilichamen.

2. T-lymfocyten spelen immuunregulerende rol, omdat ze kunnen versterken of onderdrukken de immuunreactie specifieke subpopulaties van T-cellen (T-suppressor-cellen), het schakelen van immunoglobuline synthese.

3. T-killer-cellen hebben het vermogen om doelwitcellen te doden, die vreemd zijn voor het lichaam waartegen ze eerder zijn gesensibiliseerd. Doelcellen hebben antigenen herkend door T-cellen.

4. T-cellen die mediatoren van cellulaire immuniteit produceren, die worden gevormd door de werking van antigenen. De absorptie activiteit van macrofagen, het vrijgeven van stoffen die immobilisatie makrofagov.U embryo mensen en andere zoogdieren B-lymfocyten geproduceerd door de lever en het beenmerg van stamcellen en adulte zoogdieren bevorderen - alleen in beenmerg. Differentiatie van B-cellen vindt plaats in verschillende fasen, die elk worden gekenmerkt door de aanwezigheid van bepaalde eiwitten en genetische markers mate aanpassing genen immunoglobulinov.B lymfocyten afkomstig van pluripotente hematopoietische stamcellen ook aanleiding geven tot alle bloedcellen. Stamcellen worden in een bepaald micro-omgeving die hun overleving, zelfvernieuwing en zorgt eventueel differentiatie. De micro bepaalt welk pad ontwikkeling van stamcellen (erythroïde, myeloïde of lymfoïde) [1].Differentsirovka B-lymfocyt is verdeeld in twee fasen gaat - antigennezavisimuyu (die geherrangschikte immunoglobuline-genen en hun expressie) en antigeen (waarbij activering plaatsvindt proliferatie en differentiatie in plasmacellen). Er zijn de volgende tussenvormen rijping B-lymfocyten: B vroege progenitor cells - niet synthetiseren zware en lichte ketens van immunoglobulinen omvatten

embryonale IgH- en IgL-genen, maar bevatten een antigene marker die vaak voorkomt bij volwassen pre-B-cellen.

Vroegere pro-B-cellen zijn D-J herrangschikkingen in IgH-genen.

Late pro-B-cellen - V-DJ-herrangschikkingen in IgH-genen.

Grote pre-B-cellen - IgH-genen VDJ-herschikt; In het cytoplasma zitten zware kettingen van de klas

een pre-B-celreceptor wordt tot expressie gebracht.

Kleine pre-B-cellen - V-J-herrangschikkingen in IgL-genen; In het cytoplasma zitten zware klassenketens?

Kleine onrijpe B-cellen - IgL-genen zijn VJ-herschikt; synthetiseer zware en lichte ketens; tot expressie gebracht op het membraan immunoglobulinen (B-celreceptor).Zrelye B cellen - top IgD.V celfusie afkomstig uit het beenmerg in de secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeknopen), wanneer zij verdere rijping, antigeenpresentatie, proliferatie en differentiatie in de plasmacellen en geheugen B-cellen.

1) 36. Cultuur van weefsel in virologie, classificatie, principes voor het verkrijgen van weefselculturen.

Weefselkweek, een methode om uit het lichaam te groeien in kunstmatig gecreëerde aandoeningen van cellen, weefsels of organen. in weefsel- en orgaanculturen (embryo-organen) behouden hun levensvatbaarheid of groei met behoud van de differentiatie van weefsel, structuur en functie van het orgaan. Een geïsoleerd stukje weefsel of orgaan dat wordt gebruikt voor de teelt buiten het lichaam, genaamd. explantaat. De celcultuur groeit buiten het lichaam zonder de vorming van weefsels.

Transversale profielen van taluds en kustlijn: in stedelijke gebieden wordt de kustbescherming ontworpen met inachtneming van technische en economische vereisten, maar er wordt bijzondere aandacht aan de esthetiek gehecht.

Mechanische retentie van massa's van de grond: De mechanische retentie van massa's op de helling wordt geleverd door een tegengestelde constructie van verschillende structuren.

Organisatie van oppervlaktewaterafvoer: de grootste hoeveelheid vocht in de wereld verdampt uit het oppervlak van de zeeën en oceanen (88 ° C).

© cyberpedia.suNiet de auteur van de materialen. Het exclusieve recht is voorbehouden aan de auteur van de tekst.

Als u niet wilt dat dit materiaal op onze site staat, volgt u de link: schending van het auteursrecht